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目的:分析30株白假丝酵母临床分离株中三唑类抗真菌药物耐药株的耐药机制。 方法:1.采用实验室常用抗真菌药敏试验方法(ROSCO纸片扩散法、ATBFungus3药敏板条法)对临床白假丝酵母菌株初筛,再用CLSI2002版M27-A2方案的微量稀释法对初筛的30株临床株做氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、5-氟胞嘧啶体外药敏,测定其MIC值。2.采用体外定点突变技术构建克隆质粒,再利用高保真酶扩增ERG11基因全长,并克隆到高表达质粒载体pYES2/CT中,将构建好的表达载体转染于INVScl酿酒酵母内,诱导其异源性表达。再利用体外药敏表型检测(即测定氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑MIC值)、亲和力实验(即靶酶蛋白与不同浓度氟康唑结合后,利用二型光谱定量来分析亲和力变化)米观察临床株中所发现的错义突变与三唑类抗真菌药物耐药的相关性。使用靶酶三维立体模建来阐明错义突变的作用机理。3.采用realtimeRT-PCR方法检测30株白假丝酵母中ERG11基因的表达,以18SrRNA作为内参基凶。4.采用realtimeRT-PCR方法检测30株白假丝酵母中CDR1、CDR2、MDR1外排泵编码基因的表达,以18SrRNA作为内参基因。利用罗丹明6G外排试验分析细胞膜外排泵功能,菌株在PBS中振荡培养4小时耗竭葡萄糖,摄入岁丹明6G后,菌液分成2管,一管不做处理,一管加入葡萄糖,30分钟后利用流式细胞仪FACS分析细胞荧光强度。5.对耐药菌株中CDR1、CDR2表达上调菌株的转录因子Tac1p进行初步研究,PCR扩增TAC1基因全长并测序分析。6.采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析耐药株的细胞膜甾醇成分及含量,PCR扩增其ERG3基因全长并测序分析。 结果:1.30株白假丝酵母临床菌株对两性霉素B、5-氟胞嘧啶均敏感。12株为氟康唑敏感度下降株(3株耐药株、9株剂量依赖敏感株),且同时对伊曲康唑敏感度下降。7株伏立康唑敏感度下降菌株对氟康唑敏感度下降。3株临床株对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑同时耐药。2.体外诱导药敏试验MIC增加值>=4倍为基准,除了E260V、N435V、G472R和D502E(MIC增加值<=2倍)外,其余的氨基酸(A114S、Y132H、Y132F、K143Q、K143R、Y257H、G448E)对氟康唑、伏立康唑有一定的影响,但对伊曲康唑作用不明显或是不大(MIC增加值<=2倍)。氟康唑亲和力试验结果基本和体外诱导药敏结果一致,E260V、N435V、G472R和D502E表达蛋白与氟康唑亲和力高,而其余均有一定的下降。3.敏感度下降菌株与敏感株ERG11基因表达水平差异无显著性(P=0.110)。按低于ERG11△CT[敏感株平均值]-3SD标准,H75045菌株ERG11基因表达上调,为敏感株平均值的4.86倍。4.敏感度下降菌株与敏感株CDR1、CDR2基因表达水平有显著性差异(分别为P=0.028,0.002)。敏感度下降菌株与敏感株MDR1基因表达水平差异无显著性(P=0.976)。敏感度下降菌株对罗丹明6G外排能力显著强于敏感株(P=0.001)。5.9株ABC泵编码基因表达上调的敏感度下降菌株共发现了7个错义突变及17个无义突变。7个错义突变中V104F、N199S、K772N、N776D、N896S、L935S未见报道,A736V已有所报道。其中V104F、N199S、L935S错义同时发生于敏感株中,认为这些错义突变可能与基因调控无关。6.GC-MS图谱显示仅麦角固醇、羊毛甾醇两个主峰,其他峰未见。膜甾醇成分中麦角固醇含量很高,为88%以上,其他甾醇的衍生物未见。ERG3全长测序,仅发现同义突变,未见错义突变。 结论:12株三唑类药物敏感度下降的白假丝酵母临床分离株的耐药机制与ERG11基因点突变、ABC外排泵编码基因CDR1及CDR2高表达、外排泵功能强等因素有关,与ERG11基因高表达、MDR1基因高表达、△5,6-去饱和酶失活致麦角固醇合成通路改变无关。ERG11基因错义突变中,A114S、Y132H、Y132F、K143Q、K143R、Y257H氨基酸置换与氟康唑、伏立康唑耐药相关,G448E氨基酸置换与氟康唑耐药相关,但均对伊曲康唑影响不大。TAC1基因错义突变A736V、K772N、N776D、N896S可能与耐药产生相关。