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目的:亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease,HD),是一种常染色体显性遗传的神经变性疾病。主要病因是患者第四号染色体上IT15基因中CAG三核苷酸序列重复扩增,翻译后产生含有异常扩增多聚谷氨酰胺片段(polyglutamine,PolyQs)的变异亨廷顿蛋白(Huntingtin,Htt)。其在细胞内逐渐聚集形成蛋白包涵体,并特异性地在神经元中积聚,影响神经细胞的功能,可导致纹状体投射性GABA神经元和大脑皮层锥体细胞过早死亡。最新研究发现,转录调节异常、内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ER stress)以及未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Reaction,UPR)与HD的发病高度相关,而转录调节异常在其发病机制中占有重要地位。CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT Enhancer Binding Protein Homologous Protein,CHOP)是一个应激诱导的重要转录因子,其在缺血性疾病、阿尔茨海默病、代谢性疾病及恶性肿瘤的发病中都发挥了显要作用,而在HD发病机制中的作用却鲜有报导,本研究旨在探讨变异Htt对CHOP基因表达水平及其蛋白在亚细胞位置分布的影响,从而探索CHOP在HD发病机制中的作用。研究方法:1、亨廷顿蛋白在HD PC12细胞模型中的诱导表达:运用Tet-on调控的可诱导表达EGFP标记的亨廷顿蛋白的氨基末端片断(N-Htt)分别含有23个PolyQ(N-Htt-Q23,正常型)和74个PolyQ(N-Htt-Q74,变异型)的PC12细胞模型(剑桥大学David C.Rubinsztein教授馈赠)。常规体外培养上述细胞,加入多西环素(doxycycline,Dox)分别诱导不同时间(0d,1d,3d,5d)后进行实验研究,并在各个时间点观察各组细胞内N-Htt的表达情况。2、提取Dox诱导后不同时间(0d,1d,3d,5d)HD PC12细胞的总蛋白后,BCA法测定蛋白浓度,行Western Blot实验,研究在HD PC12细胞模型中变异N-Htt对CHOP在细胞总蛋白表达水平的影响,Actin作为内参。3、提取Dox诱导后不同时间(0d,1d,3d,5d)HD PC12细胞的总RNA,应用反转录试剂盒进行反转录,利用primer premier 5.0软件设计进行Real-Time PCR反应的引物,研究变异N-Htt对CHOP基因转录水平的影响。4、分别提取Dox诱导后不同时间(0d,1d,3d,5d)HD PC12细胞的胞浆蛋白及胞核蛋白,BCA法测定蛋白浓度,用Western Blot实验分别检测各组细胞各时间点胞浆及胞核蛋白中CHOP的表达,Actin作为胞浆蛋白表达的内参,H3作为胞核蛋白表达的内参。结果:1、HD PC12细胞模型加入Dox诱导不同时间后,正常N-Htt(N-Htt-Q23)在细胞内始终均匀一致表达;而变异N-Htt(N-Htt-Q74)随诱导时间延长逐渐形成蛋白包涵体。2、正常N-Htt的表达不影响总蛋白中CHOP表达水平;而变异N-Htt的表达可显著增加总蛋白中CHOP表达水平。3、正常N-Htt的表达不影响CHOP基因的转录水平;而变异N-Htt的表达可显著提高CHOP基因的转录水平。4、正常N-Htt的表达不影响细胞胞核蛋白及胞浆蛋白中CHOP的表达水平;而变异N-Htt的表达使胞核内CHOP蛋白表达水平升高,胞浆内CHOP蛋白表达水平没有改变,即变异N-Htt可促进CHOP蛋白向核内转位。结论:1、变异N-Htt显著增加CHOP基因的转录水平及其蛋白的表达水平。2、变异N-Htt影响CHOP蛋白的亚细胞分布,促使其在细胞核内聚集。3、作为应激诱导的重要转录因子,CHOP表达水平显著增加及其在细胞核内聚集必将影响其在转录调节及内质网应激中的作用,可能在HD分子发病机制中起重要作用。