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研究目的: 1.建立维甲酸诱导的胚鼠腭裂动物模型,为研究维甲酸诱导胚鼠腭裂发生机制提供腭裂胚鼠颌面部组织。 2.采用microRNA芯片技术,通过与正常胚鼠颌面部组织对比,初步筛选出在腭裂胚鼠的颌面部组织中差异表达的microRNAs。 3.利用生物信息学技术初步分析差异表达的microRNAs及进行靶基因预测,推测差异表达的microRNA可能的生物学功能及参与的机制通路,为维甲酸诱导胚鼠腭裂发生机制提供更多的科学线索。 材料与方法: 1.建立维甲酸诱导的胚鼠腭裂模型:参照本课题组前期建立的方法,对C57BL/6孕鼠在胚胎发育第10.5天分别采用维甲酸(70mg/kg,实验组)、玉米油(对照组)灌胃,分别于胚胎发育第14.5天和18.5天两个时间点处死孕鼠,解剖胎鼠,通过大体观察、组织学染色观察两组胎鼠上腭形态及结构,统计胚鼠腭裂发生率。 2.维甲酸诱导胚鼠腭裂发生中microRNA差异表达分析:分别获取胚胎发育14.5天3例实验组胚鼠颌面部组织样本及3例对照组胚鼠颌面部组织样本(来自同一孕鼠的所有胚鼠颌面部组织作为一例样本),保存于装有RNAlater溶液的离心管,与干冰一起置于密封泡沫盒,用特快专递寄送上海康城生物公司进行芯片检测:用Trizol法提取样本RNA,用于芯片杂交前经过紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的浓度、纯度及质量。用microRNA标记试剂盒miRCURYTMArray Power Labeling Kit标记样本RNA,与miRCURY LNATMmicroRNA芯片杂交并洗涤后,用Axon GenePix4000B芯片扫描仪进行扫描。以GenePix pro V6.0进行原始数据分析,MEV software(v4.6, TIGR)进行差异表达筛选及聚类分析,以变化倍数(Fold Change)≥1.5倍,P值<0.05为差异表达筛选条件。 3.差异表达的microRNA的生物信息学分析:通过查询三个microRNA靶基因预测网站(miRanda, microCosm and TargetScan)对所有显著差异表达的microRNA进行靶基因预测,只有同时被两个或者两个以上网站共同预测到的结果才作为差异表达microRNA的候选靶基因,并构建microRNA与靶基因的调控网络,结合以往研究中与颌面部发育相关的基因结果,推测显著差异表达microRNA的功能及作用的主要信号通路。 结果: 1.大体观察及组织学观察显示:实验组胚胎发育第14.5、18.5天的32只和34只胚鼠均发生腭裂畸形,腭裂发生率为100%;对照组胚胎第14.5天、18.5天的33只和31只胚鼠均未见腭裂畸形发生。 2.维甲酸诱导胚鼠腭裂发生中相关差异表达 microRNA分析:6例胚鼠颌面部组织中共有1126个microRNAs呈现阳性表达,腭裂胚鼠颌面部组织与正常胚鼠颌面部组织中显著差异表达的microRNAs共有58个,其中39个microRNAs在腭裂胚鼠颌面部组织中表达显著上调,19个microRNAs的表达显著下调。 3.靶基因预测结果:包括 Tgfbr1,Tgfbr2,Smad7,Fgfr1等颌面部发育相关基因在内的靶基因被认为是上调microRNAs的潜在靶基因,而包括Smad2,Smad4,Fgf10等颌面部发育相关基因在内的靶基因被认为是下调microRNAs的潜在靶基因。 结论: 1.应用维甲酸70mg/kg剂量作用在胚胎发育第10.5天的C57BL/6孕鼠可诱导产生稳定可靠的胚鼠腭裂动物模型。 2.与正常胚鼠颌面部组织相比,维甲酸作用的胚鼠颌面部组织中出现 microRNAs的显著差异表达。 3.表达上调的mmu-miR-106a-5p、mmu-miR-669f-3p、mmu-miR-15a-5p、mmu-miR-98-5p和表达下调的mmu-miR-302a-3p、mmu-miR-693-5p的多个预测靶基因与颌面部发育相关,可能在维甲酸诱导胚鼠腭裂发生中具有关键作用。 4.TGF-Beta信号通路的多个关键因子和受体都是差异表达microRNA的潜在靶基因行使生物学功能的重要介质,而这些因子与受体都已经被证实在颌面部畸形的发病中有着重要的作用,因此推测,TGF-Beta信号通路可能是差异表达的microRNA参与到维甲酸诱导胚鼠腭裂发生的重要途径之一。 5.维甲酸诱导胚鼠腭裂发生相关差异表达microRNA的初步分析为我们提供了数个可能的维甲酸-microRNA-靶基因/信号通路的作用途径,为我们后续的研究提供了方向和依据。