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研究背景和目的牙种植体已成为越来越多患者首选的缺牙修复方案。但目前大多数种植体从植入到上部修复仍需至少3-6个月的骨愈合期,治疗周期过长给患者美观、咀嚼功能恢复带来不便,也影响了患者对种植术的接受程度。而且在某些骨质、骨量不佳的病例中,存在骨愈合延迟、骨整合率低等问题,影响修复治疗的效果。如何缩短骨愈合时间、提升骨整合强度,是口腔种植和生物材料学科关注的重点。种植体表面的成骨细胞源于临近组织或外周血的骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)。BMSCs向植入部位趋化性迁移、归巢,并进一步分化为成骨细胞是骨整合形成的关键环节。锶(Strontium,Sr)作为临床抗骨质疏松药物,具有良好的促成骨效应。近年来,将锶掺入骨植入材料是生物材料表面改性研究的热点。但锶促进骨整合的机制研究还不完善,掺锶种植体表面能否通过影响BMSCs归巢进而实现早期骨整合尚无研究报道。本研究采用喷砂、双重酸蚀技术结合水热合成法构建了掺锶微纳米形貌钬表面,首先对材料表面理化特性及生物相容性进行全面评价,并首次探究了该表面对BMSCs迁移、归巢行为的影响及其作用机制,最后通过体内植入实验评价该表面种植体骨整合效果。本研究内容有望为新型种植体表面的研发及临床应用提供理论和实验依据。第一部分纯钛表面掺锶微纳米形貌制备及生物相容性评目的:制备纯钛表面掺锶微纳米形貌,并检测其表征和生物相容性,为进一步评价体外及体内生物学活性打下基础。实验方法:首先将钛片表面打磨、抛光,并喷砂、双重酸蚀,形成微米多孔结构(micro-rough Ti,MT)。在MT表面上,采用氢氧化锶溶液水热反应制备出掺锶微纳米多孔钛表面(strontium-incorporated micro/nano-rough Ti,MNT-Sr)。通过扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)及X射线光电子能谱(XPS)评价样品表面形貌、化学元素组成及状态;通过粗糙度、静态水接触角实验评价样品粗糙度和亲水性;通过粘接拉伸实验和体内植入实验评价MNT-Sr涂层结合强度;通过交流电阻抗测试评价表面耐腐蚀性能;通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测Sr2+离子体外释放量。分离、培养大鼠BMSCs并接种于钛片表面,对细胞骨架F-actin蛋白和整合素Integrin β1进行免疫荧光染色,评价细胞初期黏附行为。通过AlamarBlue增殖实验评价细胞增殖活性。结果:MT表面为微米级多孔形貌,MNT-Sr表面在此基础上形成了致密的纳米颗粒(Φ40-50 nm)二级结构。MT与MNT-Sr表面均检测到Ti及Ti02衍射峰,此外,锶元素经水热反应以钛酸锶(SrTi03)形式掺入MNT-Sr表面,含锶氧化层深度约500 nm。MT与MNT-Sr表面均为适度粗糙(Ra:1.123 ± 0.091 vs.1.218±0.103,p>0.05)和亲水表面(接触角:8.44±2.23° vs.5.11±1.98°,p>0.05)。在空气中放置2周后,MT与MNT-Sr表面接触角均增大,但仍为亲水表面(65.17±14.46° vs.62.02 ± 17.51°,p>0.05)。涂层结合强度测试显示掺锶涂层与基体结合强度为49 ±0.37 MPa,骨植入过程中涂层形态完整、无剥脱。交流电阻抗测试表明MNT-Sr表面耐腐蚀性较MT表面显著提升(p<0.01)。MNT-Sr能持续向溶液中释放Sr2+离子长达14天,累计释放量为1.34±0.09 mg/l。细胞增殖实验证实MT和MNT-Sr表面均具备良好的生物相容性,但细胞在不同表面培养时增殖速率无明显差异(p>0.05)。细胞初期黏附实验结果显示,与MT相比,MNT-Sr表面能促进BMSCs黏附早期形态铺展和Integrin β1表达。结论:喷砂酸蚀结合水热反应制备的MNT-Sr表面具有良好的理化性能和生物相容性。第二部分掺锶微纳米多孔钛表面对BMSCs体外迁移和成骨分化的影响目的:评价MNT-Sr及释放的Sr2+离子对BMSCs体外迁移和成骨分化的影响,并探究Sr2+离子对SDF-1/CXCR4信号轴相关分子表达的影响。方法:制备MT、MNT表面及各自材料浸出液,BMSCs分别培养于不同钛片表面及不同浸出液中。采用钛片表面划痕实验和Transwell迁移实验分别评价MNT-Sr表面及Sr2+离子对BMSCs体外迁移的影响。采用免疫荧光、流式细胞术、免疫印迹试验、酶联免疫吸附实验和反转录-聚合酶链式反应分别在细胞水平、蛋白水平和mRNA水平检验不同培养条件下BMSCs内SDF-1/CXCR4信号轴相关分子:HIF-1 α、SDF-1α和CXCR4的表达量。在不含成骨诱导剂的培养条件下,检测BMSCs内成骨相关基因RUNX2、DLX5、SP7和ALP表达量;采用碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性定量分析来评价细胞内ALP表达水平。结果:细胞迁移实验结果显示:划痕形成18小时后,MNT-Sr表面细胞迁移率显著高于MT组(25.9±2.6%vs.20.1±1.8%,p<0.05);Transwell小室中培养12小时后,MNT-Sr浸出液(含Sr2+)吸引到达小室半透膜下壁的BMSCs结晶紫染色面积是MT浸出液组的1.4倍(p<0.01),且Sr2+的促迁移作用可以被CXCR4拮抗剂AMD3100完全阻断。在不同浸出液中培养3天和7天后,MNT-Sr浸出液能上调HIF-1α、SDF-1α和CXCR4基因表达,增强BMSCs细胞膜及总CXCR4蛋白表达水平,并促进SDF-1α分泌。成骨分化实验表明,在不含成骨诱导剂的培养条件下,MNT-Sr及其浸出液均能促进BMSCs内成骨相关基因RUNX2、DLX5、SP7和ALP表达,并提升细胞内ALP活性。结论:MNT-Sr表面通过其释放的Sr2+离子上调SDF-1/CXCR4信号轴相关分子表达,促进BMSCs体外迁移。MNT-Sr表面及Sr2+离子均能促进BMSCs成骨分化。第三部分掺锶微纳米多孔钛表面种植体促进BMSCs归巢及种植体骨整合的体内研究目的:评价MNT-Sr种植体对外源性BMSCs归巢的影响及局部组织SDF-1/CXCR4信号轴相关分子表达水平。比较MT和MNT-Sr种植体在体内早期骨整合形成情况。方法:由于BMSCs在体内缺乏特异性标记物,因此将绿色荧光蛋白(GFP)标记的BMSCs经尾静脉注射入实验大鼠体内用于示踪,并在大鼠左右胫骨干骺端随机植入MT、MNT-Sr种植体,术后1,3,7和14天取样。通过外周血单核细胞流式细胞术检测外源性BMSCs是否进入体循环。通过免疫组化染色分析GFP+BMSCs和CXCR4+细胞向种植部位归巢情况,并评价局部组织HIF-1α和SDF-1α表达量。通过GFP和骨钙素(OCN)抗原免疫荧光双重染色观察系统性注射的GFP+BMSCs是否在体内成骨分化。通过硬组织切片形态学分析,计算种植体-骨接触率(BIC)和螺纹内骨面积(BA),并结合扭力实验,共同评价种植体骨整合情况。结果:静脉注射GFP+BMSCs一天后,即可在大鼠外周血中检测到少量GFP+细胞,且细胞量随时间推移逐渐减少,表明静脉注射的BMSCs已进入大鼠外周循环。与MT种植体相比,MNT-Sr种植体周围组织HIF-1α(3天和7天)和SDF-1α(3、7和14天)表达量显著增加,在术后7天和14天募集更多GFP+BMSCs和CXCR4+细胞至种植部位。体内可观察到部分外源性GFP+BMSCs分化为成骨细胞,参与新骨形成。硬组织切片染色分析显示,术后2周时,MNT-Sr种植体BIC(61.8±5.2%vs.50.1±7.9%,p<0.05)、BA(23.6±6.5%vs.17.8±3.5%,p<0.05)及扭力值(10.5 ±3.2 vs.7.7±2.3 N/cm,p<0.05)均明显高于MT种植体组,表明MNT-Sr种植体能促进早期骨整合形成。结论:MNT-Sr种植体能上调局部组织SDF-1/CXCR4信号轴表达水平,促进外源性BMSCs和内源性CXCR4+细胞归巢,进而实现种植体早期骨整合。