胶原蛋白是动物细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的主要组成部分,为皮肤、骨骼、肌腱等结缔组织提供结构框架。胶原蛋白是由三螺旋的原胶原蛋白分子通过分子间各种相互作用以及多种共价交联组装而成,其功能的发挥也依赖于超分子组装过程。胶原蛋白酶是指能够在生理条件下水解天然胶原蛋白的蛋白酶,根据来源不同被分为动物胶原酶和微生物胶原酶。致病性弧菌是人类和某些水生生物的病原体,其分泌的胞外金属蛋白酶与弧菌的发病机制密切相关。根据氨基酸的序列相似性、底物特异性以及结构域组成不同,弧菌胞外金属蛋白酶主要被分为来自M4家族的Class Ⅰ蛋白酶,来自M9A亚家族的Class Ⅱ和ClassⅢ蛋白酶。Class Ⅰ蛋白酶主要通过对具有重要生理功能的蛋白质的降解或对其他毒素的激活作用参与弧菌的致病过程,并且因其耐热或有机溶剂的特性具有工业应用潜力。Class Ⅱ和Class Ⅲ蛋白酶具有胶原蛋白酶活性,是细菌胶原蛋白酶的重要成员之一,主要通过降解宿主ECM中的天然胶原蛋白组分加速细菌的传播、促进弧菌在宿主中的定植以及其他毒素的扩散,已经被确定为重要的致病因子。尽管已经有许多弧菌胶原酶被鉴定和表征,但对于M9A亚家族弧菌胶原酶降解胶原蛋白的机制研究很有限。不仅如此,由于缺乏结构信息,目前对弧菌胶原酶识别和降解胶原蛋白的机制仍然不清楚。本论文研究了弧菌三种类型胞外金属蛋白酶对胶原蛋白的作用机制,主要包括M4家族Class Ⅰ蛋白酶对胶原蛋白的膨胀作用以及M9A亚家族Class Ⅱ和Class Ⅲ胶原酶对胶原蛋白的降解机制。（1）M4家族Class Ⅰ蛋白酶VP9对胶原蛋白的膨胀作用海洋细菌Vibrio pomeroyi strain 12613分泌的蛋白酶VP9在实验室的前期工作中被鉴定为一个M4家族Class Ⅰ蛋白酶。本研究进一步对VP9进行异源表达和分离纯化,成功地获得了成熟的重组酶VP9,并对它进行了表征。VP9对酪蛋白和明胶有活性,但不能降解Ⅰ型胶原蛋白和弹性蛋白。此外VP9具有良好的热稳定性,在pH 5.0-11.0是稳定的,对NaCl、非离子去垢剂以及有机溶剂甲醇等有良好的耐受性,这些特性为发挥其工业应用潜力奠定了基础。VP9虽然不能降解胶原蛋白,但对Ⅰ型不溶性胶原纤维有明显的膨胀作用。在37℃下用10μM VP9处理牛Ⅰ型不溶性胶原纤维12小时后,胶原纤维的体积膨胀了大约八倍。原子力显微镜（atomicforcemicroscopy,AFM）观察和生化实验的结果表明VP9能够特异性降解胶原纤维中的蛋白聚糖,进而引起胶原原纤维的解离和胶原纤维的膨胀。糖蛋白是ECM中与胶原蛋白相互作用的非胶原组分,VP9对糖蛋白也有降解作用。VP9对蛋白聚糖和糖蛋白的降解引起胶原蛋白和ECM的结构被破坏,暗示其具有影响宿主ECM生理功能的致病性作用。此外,VP9对ECM中的非胶原组分蛋白聚糖和糖蛋白的特异性降解而对胶原蛋白无活性的特性暗示着其在皮革加工业的纤维开解和皮革脱毛的工艺流程中可能具备应用潜力。（2）M9A亚家族Class Ⅱ胶原酶VP397对胶原蛋白的降解模式M9A亚家族ClassⅡ胶原酶VP397来源于海洋细菌V.pomeroyi strain 12613。VP397的结构域组成包括激活结构域（activator domain）和肽酶结构域（peptidase domain）构成的胶原酶催化模块（collagenasemodule,CM）和两个附属PPC结构域（pre-peptidase C-terminal domain,PPC domain）。VP397 对多种类型的胶原底物都具有活性,比如鱼胶原蛋白、Ⅰ-Ⅴ型哺乳动物来源的胶原蛋白。通过AFM观察和生化分析,进一步研究了 VP397对牛Ⅰ型不溶性胶原蛋白的降解模式。结果表明VP397通过率先攻击C端端肽（C-telopeptide）破坏胶原纤维的致密结构并解离出原胶原分子片段。VP397偏好切割三螺旋区域肽链中重复的Gly-X-Y三联体中的Y-Gly键,将原胶原片段水解成小肽和氨基酸。此外,结构域缺失突变分析表明,VP397中单独的胶原酶催化模块具有Ⅰ型胶原蛋白水解活性;中间的PPC1结构域无胶原结合或膨胀能力,可能作为铰链区（linker）连接上下游结构域;C端的PPC2结构域有胶原结合能力但无胶原膨胀能力,可能在胶原降解过程中起到胶原结合结构域（collagenbinding domain,CBD）的作用。基于以上研究结果,我们提出了 VP397的胶原降解模式模型。本论文关于M9A亚家族ClassⅡ胶原酶VP397对牛Ⅰ型不溶性胶原蛋白的降解模式研究,为阐明弧菌胶原酶在弧菌致病过程中的作用与机制提供了新的见解,并有助于开发其在工业和医疗领域的应用潜力。（3）M9A亚家族Class Ⅲ胶原酶VhaC的酶学性质和结构M9A亚家族弧菌胶原酶通过降解ECM中的胶原组分与弧菌的发病机制密切相关。然而,目前关于弧菌胶原酶降解胶原蛋白的结构基础和分子机制仍未被阐明。本论文对来自海洋致病性弧菌Vibrio harveyi VHJR7的Class Ⅲ胶原酶VhaC进行了异源表达、分离纯化以及酶学性质研究。作为一个Class Ⅲ胶原酶,VhaC由包含激活结构域和肽酶结构域的胶原酶催化模块（CM）、PKD-like结构域（polycystic kidney disease-like domain,PKD-like domain）以及 C 端的 PPC 结构域组成。VhaC在溶液中以单体形式存在,对鱼胶原蛋白、Ⅰ-Ⅱ型牛来源的胶原蛋白、Ⅲ-Ⅴ型人来源的胶原蛋白以及明胶都具有活性。VhaC胶原酶催化模块CM的晶体结构被解析,分辨率为1.8 A。CM的晶体结构呈马鞍状,与目前M9家族中唯一已知的M9B亚家族梭菌胶原酶ColG的CM的马鞍状晶体结构相似,但VhaC的CM的催化腔更加收缩,并且缺少ColG中的催化辅助子域（catalytic helper subdomain）。此外,小角度射线散射（small-angle X-ray scattering,SAXS）分析表明VhaC各结构域的并排排列导致了其在溶液中呈现一个长而平坦的整体构象,C端PPC结构域通过一段灵活的linker与VhaC的核心区域相连,并向外延伸。本研究首次揭示了弧菌胶原酶VhaC的胶原酶催化模块的晶体结构及其在溶液中的整体构象,为进一步研究其对胶原蛋白识别和降解的分子机制奠定了结构基础,并有助于针对弧菌胶原酶进行基于结构的药物设计。（4）Class Ⅲ胶原酶VhaC的胶原酶催化模块对胶原三螺旋分子的结合和催化机制生化实验表明胶原酶催化模块CM是VhaC独立降解三螺旋胶原蛋白的最小单元。通过生化分析、突变分析以及分子动力学模拟等手段,本论文研究了 CM对胶原三螺旋识别和催化的分子机制。结果表明,激活结构域在CM对胶原三螺旋分子和胶原纤维的降解中起着底物结合的作用,其中Phe107、Arg153以及Tyr157是CM中参与底物结合的关键氨基酸残基。除此之外,我们的研究结果还证实了 CM对肽底物和胶原三螺旋分子采取不同的识别策略,即肽底物直接由肽酶结构域识别和降解,而三螺旋分子是由激活结构域识别的。此外,CM在动力学模拟过程中表现出持续的构象开合变化。进一步分析CM与三螺旋分子复合物模型的动力学模拟过程表明,随着体系逐渐达到平衡,起始结合于激活结构域的三螺旋分子通过CM的构象闭合运动靠近肽酶结构域的催化中心。结合对肽酶结构域催化中心的关键残基的生化验证,我们提出了 VhaC的激活结构域负责胶原三螺旋分子最初识别,随后由CM的闭合运动驱动三螺旋分子水解的胶原识别和催化机制。这是首次阐释M9A亚家族弧菌胶原酶对三螺旋胶原分子的识别和降解机制。（5）Class Ⅲ胶原酶VhaC的PKD-like和PPC结构域的功能以及VhaC对胶原蛋白的降解机制Class Ⅲ胶原酶VhaC除了包含一个胶原酶催化模块CM外,还含有附属的PKD-like结构域和PPC结构域。结构域缺失突变分析表明两个附属结构域缺失任何一个都会显著影响VhaC对胶原纤维的活性。结构域功能分析表明,PKD-like结构域不能结合或膨胀胶原蛋白,作为一个中间结构域,我们认为它很可能在胶原降解过程中发挥linker的作用连接上下游结构域。VhaC的PPC结构域不具备胶原膨胀能力,但具有明显的胶原纤维结合能力,因而很可能在胶原蛋白降解过程中充当CBD。结构分析显示PPC结构域通过一段灵活的linker与核心区域连接,适合其发挥胶原结合功能。通过AFM观察和生化分析,进一步研究了VhaC对Ⅰ型胶原纤维的降解模式。结果表明,Class Ⅲ胶原酶VhaC展现出与Class Ⅱ胶原酶VP397相似的胶原蛋白降解模式。它们都是通过率先降解C-telopeptide来瓦解胶原原纤维,游离出原胶原分子片段。都以切割胶原蛋白肽链Gly-X-Y重复三联体中Y-Gly键的方式逐步将原胶原片段水解成小肽和氨基酸。最后,结合VhaC的胶原酶催化模块CM识别和催化胶原三螺旋分子的机制、附属结构域在胶原降解过程中的功能以及VhaC的胶原纤维降解模式,我们提出了M9A亚家族Class Ⅲ胶原酶VhaC对胶原蛋白的降解机制模型。综上所述,我们深入研究了弧菌的M4家族Class Ⅰ蛋白酶对胶原蛋白的膨胀机制以及M9A亚家族Class Ⅱ和Class Ⅲ胶原酶对胶原蛋白的降解机制。研究结果有助于深层次地理解弧菌胞外金属蛋白酶的致病性作用以及开发它们在应用潜力。