GRFs（Growth-Regulating Factors）是高等植物中高度保守的一类转录因子,对植物的生长发育具有重要的调节作用。许多证据表明GRFs能促进几乎所有植物器官的生长发育,主要通过刺激各器官原基细胞的分裂来促进生长。植物中第一个被鉴定的GRF成员是OsGRF1,在筛选水稻中响应赤霉素的基因时发现。水稻中含有12个GRF成员,多数的mRNA表达水平能被赤霉素所诱导,但响应机制不甚清楚。1 1个水稻GRF的mRNA能与miR396高度配,因而被认为是miR396的靶基因。尽管miR396被认为还可能作用其它基因,但miR396-GRF模块具有更高程度的保守性,即它们会同时出现于高等植物中。水稻中有8个miR396基因,它们所产生的成熟microRNA序列几乎相同,但前体序列差异较大。microRNA作为调节类小分子RNA,它们的生物学功能很大程度上取决于如何调节靶基因。此处,为了研究miR396-GRF模块对水稻发育的影响,我们探索了以下5个方面的内容:1.构建和转化了以Ubi1（泛素）启动子驱动miR396a的过表达载体pUbi1:miR396a,并获得了转化植株,经潮霉素筛选,T1代的转基因株系表现出发育受阻的现象,体现为萌发延迟、茎秆矮化、根长缩短、地上与地下部分生物量均减少等表型。分子证据表明,转基因株系中的miR396a的前体表达水平显著升高,而靶基因的表达水平明显下降。2.合成了 miR396 的 STTM（Short Tandem Target Mimic;短串联目标模拟,用以干扰miR396）表达载体pUbi1:miR396-STTM,转化水稻并获得了转化植株。在苗期,T1代阳性植株出现轻微程度的快速增长现象,其株高、根长和叶片面积都有轻微增大的现象。分子证据表明STTM的结构部分获得了表达,而个体OsGRF的mRNA的表达水平下降。3.为了研究特定miR396成员的表达特征,因miR396c的启动子序列特征较鲜明,我们克隆了 miR396c的启动子。用其驱动报告基因GUS（β-Glucuronidase,β-半乳糖苷酸酶）,并将表达载体pmiR396c:GUS导入水稻,获得转化植株。通过GUS染色,发现miR396c表达于幼苗茎秆的靠近种子的基部以及茎秆节的区域,即茎秆生长最缓慢的地方,但于根中未观察到GUS的表达。多种胁迫能诱导GUS表达的上升,这些胁迫包括低温、高盐、微酸、及机械损伤等。对转基因植株用赤霉素处理一周后,其GUS表达水平显著下降。4.OsGRF10由于C端序列明显短于其它GRF成员,而C端的功能可能与其转录激活活性相关。我们克隆了GRF10的序列,依据密码子的简并性,在miR396的作用位点突变了5个碱基,但仍然保持了原来氨基酸的序列,以帮助其逃避miR396的作用。构建并转化了表达载体pUbi1:mOsGRF10,获得转化植株。在苗期阶段,GRF10过表达株系发育受阻,出现一定程度的矮化现象。qRT-PCR表明,OsGRF10的表达水平升高,这可能是因为OsGRF10的过表达竞争性地抑制了其它OsGRF成员但却没有C端的转录激活功能所致。5.制作 了大量的pUbi1:miR396a、pUbi1:miR396-STTM、pUbi1:mOsRF10 和pmiR396c:GUS的愈伤组织,统计了它们再生植株的效率,发现pUbi1:miR396-STTM的再生效率显著高于其它载体的转化率,这可能是由其靶基因表达的上升所致,而pUbi1:miR396-STTM的再生率最低。结论:（1）GRF是水稻生长的正调节因子,该家族成员促进水稻的多器官生长。但GRF10的作用相反,因其序列的特殊性,它表达的上升可能会竞争性地抑制其它GRF的功能从而导致水稻生长受阻。（2）miR396的表达与GRF呈相反的模式,即miR396表达于生长缓慢的组织,而GRF表达于生长旺盛的组织,这种反向模式系由miR396负调节GRF所致,miR396高表达的组织中GRF的表达必然受到抑制。（3）miR396作为调节分子,在胁迫下其表达的上升会导致GRF表达的下降从而抑制水稻的生长,这是水稻适应胁迫的分子机制。但赤霉素却能下调miR396的表达,下调的miR396致使GRF的表达上升,这可能是GRF正响应赤霉素的原因。可能也是赤霉素刺激水稻的生长原因之一。（4）上升的GRF表达水平能促进水稻愈伤的再生,这在植物基因工程的未来应用中展现出一定的潜力。我们的研究结果有助于进一步阐明水稻miR396-GRF模块调控生长发育的角色及它如何响应环境,也有助于加深对其生理学意义的理解。