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中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)是中国一类极富营养价值的经济鱼种,远销港澳等地。但随着人工养殖业的蓬勃发展以及养殖密度的增大,在水体环境中的各类微生物数量增加。当微生物侵染中华乌塘鳢时,会导致产生相关的疾病,影响其养殖业的发展,是生产过程中面临的主要问题。中华乌塘鳢是低等脊椎动物,由于特异性免疫并不发达,依赖先天免疫抵抗微生物入侵。先天免疫系统主要是通过TLRs、NLRs和RLRs三类家族识别病原相关分子模式(PAMPs)发挥免疫应答反应,引起促炎细胞因子以及干扰素的表达。其中RLRs是一类新型的胞内识别病毒的模式识别受体家族,在抗病毒免疫反应中发挥重要的作用。这类家族由三个成员组成,它们分别是LGP2(Laboratory of Genetics and Physiology2)、RIG-I(retinoic acid-inducible gene 1)和MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)。结构上,RIG-I和MDA5蛋白在N末端具有两个串联CARD结构域,可以通过CARD-CARD结构域与定位在线粒体膜上的抗病毒信号蛋白(MAVS)相互作用来激活免疫途径,LGP2缺少CARD结构域,但同样有复杂的调控作用。本研究根据实验室转录组中的已有基因序列,通过PCR克隆得到中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因,并用生物信息学方法分析其分子特征,利用Real-time PCR方法检测中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因在poly(I:C)感染后的表达水平变化,推测LGP2、MDA5和MAVS基因在中华乌塘鳢抗病毒免疫中的作用。中华乌塘鳢LGP2基因(BsLGP2)的编码序列为2040 bp,编码679个氨基酸。经预测发现BsLGP2蛋白包括DEXDc、HELICc和RD三个保守的结构域。Real-time PCR实验结果说明BsLGP2基因在健康中华乌塘鳢的10个组织中普遍表达,在头肾中表达量最高,而在肠中表达很低。注射poly(I:C)后除脾脏外的其他免疫器官早期BsLGP2基因表达量明显上调。在外周血中BsLGP2基因表达量持续上调(48 h,约158倍);BsLGP2基因表达量在头肾和肝脏中的12 h达到峰值(约17倍和约70倍);而BsLGP2基因在脾脏中早期表达量下调,12 h后表达量迅速上调并在24 h达到最高峰(约1.3倍)。这说明BsLGP2基因可能在先天抗病毒免疫中发挥正调控作用。BsMDA5编码序列为2988 bp,编码995个氨基酸。预测BsMDA5蛋白的结构域是保守的,它们分别是CARDs、DEXDc、HELICc和RD。BsMDA5基因在试验的所有组织中均有表达,在皮肤中表达量最高,其次是外周血,但在肠和脑中表达量很低。相比对照组(PBS)中的BsMDA5基因表达水平变化,在poly(I:C)刺激下的免疫组织中迅速上调,且展现先上升达到峰值后急速下降的趋向。在外周血、头肾和肝脏中BsMDA5在3 h表达量明显上调,在12 h达到最高表达量(约30倍,约3.78倍,约21.78倍)。脾脏中BsMDA5基因表达量在24 h达到峰值(约3.22倍),说明中华乌塘鳢MDA5基因在先天免疫反应中发挥重要的调控作用。BsMAVS编码序列为2484 bp,编码827个氨基酸。预测发现BsMAVS蛋白包括1个保守的CARD结构域和2段内部重复序列(RPT1)。通过Real-time PCR检测BsMAVS基因在正常中华乌塘鳢组织广泛表达,且在头肾和脾脏中表达量最高,而在肠中具有很低的表达量。在poly(I:C)刺激后的外周血、头肾、脾脏和肝脏中,BsMAVS基因表达量在外周血中迅速且明显上调,并持续表达(48 h,约30倍);在头肾中BsMAVS基因的表达量在3 h-12 h呈现下调表达,但在12 h后表达量明显上调,并在24 h达到最高峰(约1.3倍);BsMAVS基因在肝脏中早期表达量上调并达到峰值(3 h,约1.53倍);脾脏中BsMAVS基因表达量在早期下调,6 h后迅速上升并在12 h达到峰值(约1.2倍),推测BsMAVS基因在先天免疫应答反应中发挥重要作用。总之,本研究中克隆了中华乌塘鳢LGP2、MDA5和MAVS基因编码序列,初步研究了LGP2、MDA5和MAVS基因的表达分析。研究结果表明BsLGP2可能在先天抗病毒免疫中发挥正调控作用,是RLR抗病毒信号通路中的正调控因子;BsMDA5基因可能参与先天抗病毒免疫应答并发挥重要作用;BsMAVS基因虽缺失TM结构域,但仍在先天抗病毒免疫反应中发挥作用。这为研究中华乌塘鳢RLR信号途径及相关分子机制奠定基础,对中华乌塘鳢疾病的预防和控制起到一定的指导作用。