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研究目的:口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）在头颈部恶性肿瘤中的比例高达90%,其发病率至2030年左右预计将增加30%[1]。OSCC极易出现颈部淋巴结转移,由于其转移的机制尚未完全阐明,患者死亡率居高不下,五年生存率仅为40%-50%[2,3]。因此,有必要进一步阐明OSCC转移的具体机制,进而寻找更为有效的治疗策略。肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages,TAMs）作为肿瘤微环境中主要的非癌细胞,可以分为具有抗肿瘤特性的M1和促肿瘤特性的M2两种表型,其中M2型TAMs在OSCC的发生和发展过程中扮演着重要的角色[4]。白藜芦醇（resveratrol,RES）是一种具有抗肿瘤活性的天然植物雌激素,可能成为治疗OSCC的潜在药物[5]。本研究旨在通过调查白藜芦醇对OSCC的侵袭转移的影响及对TAMs极化状态的调控,进一步探讨脾酪氨酸激酶（Syk）通路在TAMs极化状态调控中的作用,进而阐明白藜芦醇治疗OSCC的具体作用机制,为OSCC治疗和预后提供实验依据和潜在策略。研究方法:1.收集人OSCC细胞CAL27条件培养基（CAL27 Conditional Medium,CAL27-CM）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7,q RT-PCR及ELISA法检测TAMs标志细胞因子的m RNA及蛋白表达水平;免疫荧光法检测TAMs表面蛋白表达水平;光镜下观察TAMs的形态学变化。验证CAL27-CM诱导RAW264.7得到M2型TAMs。2.CCK-8法检测不同浓度的RES干预对TAMs及巨噬细胞存活情况的影响;使用安全浓度的RES干预M2型TAMs（R-RES组）及在CAL27-CM诱导RAW264.7同时加入RES干预（RES组）,Transwell小室实验及细胞划痕实验检测在不同实验分组中的CAL27细胞的侵袭转移水平。分析RES通过TAMs对CAL27细胞侵袭转移能力的影响。3.使用RES干预M2型TAMs及RAW264.7,q RT-PCR及ELISA法检测TAMs标志细胞因子的m RNA及蛋白表达水平;免疫荧光法检测TAMs表面蛋白表达水平;光镜下观察TAMs的形态学变化。分析RES对TAMs极化状态的调控情况。4.使用RES干预M2型TAMs及RAW264.7,Western Blot实验检测其Syk、p-Syk的蛋白表达水平;使用Syk抑制剂Entospletinib（GS-9937）干预CAL27-CM诱导RAW264.7,q RT-PCR及ELISA法检测TAMs标志细胞因子的m RNA及蛋白表达水平;免疫荧光法检测TAMs表面蛋白表达水平。分析RES通过Syk通路对TAMs极化状态的调控情况。5.使用GS-9937干预CAL27-CM诱导RAW264.7,Transwell小室实验及细胞划痕实验检测在不同实验分组中的CAL27细胞的侵袭转移水平。分析抑制TAMs中Syk通路对CAL27细胞侵袭转移能力的影响。研究结果:1.与未经处理的RAW264.7相比,用CAL27-CM干预的TAMs中M2标志细胞因子IL-10、Arg-1、TGF-βm RNA表达量以时间依赖性明显上调,24h时IL-10的蛋白分泌水平显著提高,CD206荧光强度明显增强;光镜下观察,巨噬细胞RAW264.7呈圆形,聚集生长,而TAMs体积更大并伸出伪足,且更为分散。说明CAL27-CM诱导RAW264.7 24h能够得到M2表型的TAMs。2.CCK-8实验结果表明,在R-RES组和RES组中,浓度在20μM以内的TAMs细胞存活率大于80%,而40μM细胞存活率明显下降;Transwell迁移和侵袭实验结果表明:与Control组（0μM）相比,R-RES组（20μM）及RES组（20μM）CAL27细胞穿过膜的细胞数量明显减少;细胞划痕实验结果显示:与Control组（0μM）相比,R-RES组（20μM）及RES组（20μM）CAL27细胞划痕面积显著缩小。说明白藜芦醇能够通过干预TAMs抑制CAL27细胞的侵袭转移能力。3.q RT-PCR结果可见:与Control组（0μM）相比,R-RES组（20μM）TAMs中TGF-β、IL-10（M2型TAMs标志）的m RNA表达量下调,而TNF-α、IL-12、i NOS（M1型TAMs标志）的m RNA表达量上调;RES组（20μM）TAMs中TNF-α、IL-12、i NOS m RNA表达量显著上调,TGF-β、IL-10、Arg-1 m RNA表达量显著下调;ELISA结果显示,与Control组（0μM）相比,R-RES组（20μM）及RES组（20μM）TAMs的TNF-α蛋白分泌水平显著升高,而IL-10的蛋白分泌水平显著降低;免疫荧光结果显示,与Control组（0μM）相比,R-RES组（20μM）及RES组（20μM）TAMs的CD206（M2型TAMs标志）荧光强度减弱,CD86（M1型TAMs标志）荧光强度表达增强;光镜下显示,经过白藜芦醇处理后,TAMs伪足数量减少,形态趋近于圆形,与Control组有明显区别。说明白藜芦醇对TAMs极化状态的调控一方面能够将M2型TAMs再教育为M1表型,另一方面能够抑制巨噬细胞向M2表型极化、促进其向M1表型极化。4.Western Blot结果表明:与Control组（0μM）相比,R-RES组（20μM）及RES组（20μM）Syk蛋白表达无明显变化,p-Syk蛋白表达显著降低,说明白藜芦醇能够下调TAMs中Syk通路激活水平;q RT-PCR结果显示,与Control组（0μM）相比,GS-9937组（1μM）TAMs中TNF-α、IL-12、i NOS的m RNA表达量上调,IL-10、Arg-1的m RNA表达水平下调,TGF-β表达略有升高但无统计学意义;ELISA结果显示,与Control组（0μM）相比,GS-9937组（1μM）TAMs中TNF-α蛋白分泌水平显著升高,IL-10蛋白分泌水平显著降低;免疫荧光结果显示,与Control组（0μM）相比,GS-9937组（1μM）TAMs的CD86荧光强度表达增强,CD206荧光强度减弱。结果说明,白藜芦醇能够通过抑制TAMs中Syk蛋白磷酸化调控TAMs的极化状态。5.Transwell结果显示:与Control组（0μM）相比,GS-9937组（1μM）CAL27细胞穿膜的细胞数量明显减少。细胞划痕实验结果显示:与Control组（0μM）相比,GS-9937组（1μM）CAL27细胞划痕面积显著缩小。说明抑制TAMs中Syk通路能够明显抑制CAL27细胞的侵袭转移能力。研究结论:1.CAL27细胞条件培养基能够将巨噬细胞诱导为M2型TAMs;2.白藜芦醇通过TAMs抑制口腔鳞癌细胞的侵袭转移;3.白藜芦醇能够促进巨噬细胞向M1表型极化,抑制其向M2表型极化,并将M2表型的TAMs再教育为M1表型;4.白藜芦醇通过抑制Syk通路的激活调控TAMs的极化状态,进而抑制口腔鳞癌细胞的侵袭转移。