龙眼(Dimocarpus longan Lour.),又名桂圆,是重要的亚热带木本果树,含有丰富的糖、铁以及蛋白质,具有食用和药用价值。龙眼胚胎发育与其果实的产量及品质密切相关。可变剪接是产生蛋白质多样性的重要因素,Sm蛋白是一种重要的RNA结合蛋白,主要包括Sm蛋白和LSm蛋白。一方面,Sm核心蛋白能够形成多种七聚环配合物与sn RNPs结合参与可变剪接体的组装,在前体m RNA剪接中起作用;另一方面LSm与U6sn RNP属于非永久结合,因此比Sm蛋白具有更广泛的作用。研究表明LSm蛋白能提高植物的抗旱能力,提高植物对盐胁迫的敏感性,并且能参与植物的生物钟调节。然而,目前Sm蛋白家族的功能研究主要集中在拟南芥等模式植物,在木本果树中,尤其是龙眼体胚中尚未见报道。因此,本研究对龙眼Sm蛋白进行了全基因组鉴定及生物信息学分析;利用转录组数据分析该家族的可变剪接(AS)、单核苷酸多态性(SNP)和插入缺失标记(In Del);参考龙眼基因组,克隆验证了Dl LSm14s全长,并构建p CAMBIA1302-Dl LSm14s-GFP载体进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术分析不同激素及温度胁迫下Dl LSm14s的表达;对Dl Sm家族的mi RNAs进行预测和验证,为Dl Sm家族的功能研究提供科学依据。主要研究结果如下:1龙眼Dl Sm全基因组鉴定及表达分析以拟南芥的氨基酸序列为探针序列,利用龙眼基因组数据库,通过本地blast鉴定得到29个Dl Sm基因。启动子分析表明,Dl Sm基因含有大量与光、厌氧诱导、生理昼夜节律控制、胚乳发育以及多种激素相关的响应元件,这表明该家族成员不仅与龙眼的抗逆相关,也能够参与植物的生长发育。Dl Sm家族的AS分析表明,龙眼NEC阶段AS事件最多,各阶段均产生了差异的AS事件,可能与龙眼体胚分化有关。NEC阶段内含子保留(IR)的大量发生可能影响龙眼体胚发生,而Dl LSm14c可能促进龙眼EC向GE分化。无论是体胚发生阶段还是不同组织部位中,Dl LSm14s发生的AS事件都明显多于其他成员,推测该亚组成员在体胚分化以及器官发育中有重要作用。不同激素处理下,仅有Dl LSm14c的AS事件发生变化。蓝光下产生较多的特异性剪接,无论何种处理下,Dl LSm14c发生的AS事件都是最多的。该成员可能参与激素和光质的某些通路。Dl Sm家族的碱基多态性分析表明,Dl Sm家族的碱基多态性在不同龙眼品种存在差异。分析龙眼非胚性愈伤组织(NEC)和体胚发生早期Dl Sm基因的表达情况,并综合不同组织部位的FPKM值分析,发现有4个Dl LSm14成员在胚性愈伤组织(EC)阶段高表达,并且3个成员在种子中高表达,推测该亚组成员可能与龙眼体胚发生以及胚性维持有关。FPKM-’q RT-PCR’比较分析发现从EC到球形胚(GE)阶段,有25个基因的表达下降。推测Dl Sm基因的表达受龙眼体胚生长和分化的影响,并随着体细胞胚胎分化程度的增加而降低。不同激素和光质处理下,发现Dl LSm4b、Dl LSm14c、Dl LSm14e和Dl LSm8仅在含有细胞分裂素(KT)的处理下高表达,推测上述基因可能与KT促进体胚分化相关。白光能促进龙眼EC的Sm基因表达,而蓝光能抑制Sm基因的表达。2 Dl LSm14s基因克隆、生物信息学分析及亚细胞定位分析为探究Dl LSm14s的功能,克隆验证了Dl Sm14a、Dl Sm14d和Dl Sm14e的c DNA全长序列,分别为1791bp(Gen Bank登录号:MT326637)、1929bp(Gen Bank登录号:MT326638)和1707bp(Gen Bank登录号:MT326639),编码596、642和568个氨基酸。磷酸化修饰位点预测表明,3个蛋白富含丝氨酸和苏氨酸的磷酸化修饰位点,但位点数量以及分布有所不同,可能使其产生功能上的差异。系统发育分析表明,Dl LSm14s与漾濞槭(Acer yangbiense)、甜橙(Citrus sinensis)具有较近的亲缘关系。利用无缝克隆技术构建p CAMBIA1302-Dl LSm14s-e GFP融合载体,烟草叶片亚细胞定位观察表明,3个基因均为核定位基因。3激素和非生物胁迫处理下Dl LSm14s的表达分析利用q RT-PCR技术分析脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和赤霉素(GA)处理不同时间以及不同浓度KT处理下Dl LSm14s的表达。结果表明,Dl LSm14a、Dl LSm14c、Dl LSm14d和Dl LSm14e对这5种激素均有响应,不同成员的响应表达模式不同。ABA和Me JA瞬时处理(24 h时),对4个Dl LSm14基因具有正调控作用,可能通过促进其表达参与相关逆境胁迫应答。GA处理24 h对Dl LSm14a、Dl LSm14c和Dl LSm14d有负调控作用。SA处理(24 h)对Dl LSm14a有正调控作用,对Dl LSm14c和Dl LSm14d有负调控作用。Dl LSm14s对外源激素的响应表达模式的差异可能反映了基因功能上的差异。低温胁迫和热胁迫下的q RT-PCR分析结果表明,低温处理(24 h)能促进Dl LSm14a和Dl LSm14e的表达,抑制Dl LSm14c和Dl LSm14d的表达。说明4个基因对低温的响应并不相同。热胁迫(24 h)下,4个基因的表达量相较对照均升高。这表明,4个基因可能参与了龙眼体胚热胁迫下的某些调控途径。4 Dl Sm家族mi RNAs预测及验证为进一步了解Dl Sm基因与mi RNAs之间可能存在的调控关系,对Dl Sm家族mi RNAs进行预测。预测结果表明有6个成员含有保守的mi RNA抑制位点,其中Dl LSm14s含有mi R156和mi R393裂解位点,而Dl LSm2仅含有mi R319翻译位点。Dl LSm14s极可能与这些mi RNA存在调控关系,进而影响龙眼体胚发生。结果表明,mi R156a能够裂解Dl LSm14a,推测Dl LSm14a可能与mi R156a存在一定的调控关系。综上所述,Dl Sm蛋白家族是一个高度保守的蛋白家族,该家族成员的启动子含有大量与龙眼体胚发生和植物生长发育相关的元件。其中Dl LSm14亚组成员发生大量可变剪接、单碱基突变和插入缺失标记,其表达量随体胚发生时期变化,并受不同激素和温度调控,可能对龙眼体胚发生有重要的调控作用。