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近年来,随着世界范围内工业化与城市化进程不断加快,大量工业与生活废水未经处理直接排入自然水体,造成水体严重富营养化,蓝藻水华频频发生,产生大量微囊藻毒素(Microcystins,MCs)并释放进入水体中,致使许多河流、湖泊和水库等饮用水源都面临微囊藻毒素严重泛滥的问题。蓝藻细胞破裂后产生的微囊藻毒素是一类天然的单环七肽类化合物,在迄今发现的100余种MCs的异构体中,microcystin-LR(MC-LR)毒性最强且分布最广。研究表明MC-LR具有肝肾毒性、胃肠毒性、神经毒性等多种脏器毒性。本实验室率先通过急、慢性动物实验发现MC-LR具有雄性生殖毒性,可进入睾丸组织、造成睾丸结构损伤以及精子数量和质量下降。前列腺作为雄性最大的附属性腺,对维持雄性正常生殖功能起重要作用。为此,本研究以前列腺为研究对象,通过动物和细胞水平检测MC-LR是否进入前列腺组织及前列腺上皮细胞中,观察其分布状况并确定其对前列腺的毒性作用,对保障雄性生殖健康具有重要的理论意义和实践价值。全文分为两部分:第一部分MC-LR急性和慢性染毒对小鼠前列腺结构及功能影响的研究一、目的通过急性和慢性动物实验,探究MC-LR染毒后在前列腺中的分布状况及对前列腺结构和功能的影响。二、方法1、96只6周龄雄性BALB/c小鼠(20g左右)随机分为3大组:1天,4天和7天组,每个组分为4个小组:1个对照组和3个实验组,每组8只小鼠,实验组中,小鼠腹腔注射含 MC-LR 浓度分别为 7.5 μg kg b.w.-1 day1、15μg kg b.w.-1 day-1和30μg kg b.w.-1 day-1的生理盐水。对照组中,小鼠腹腔注射生理盐水。分别注射1天,4天和7天后,眼球取血,然后颈椎脱臼处死,取前列腺等脏器备用。2、100只6周龄雄性BALB/c小鼠(20 g左右)随机分为2大组:3个月和6个月,每个组分为5个小组:1个对照组和4个实验组,每组10只小鼠,实验组中,小鼠的饮用水中MC-LR浓度分别为1 μg/L、10 μg/L、20 μg/L和30μg/L;对照组中,喂不含MC-LR的正常饮用水。分别饲养3个月和6个月后,眼球取血,然后颈椎脱臼处死,取前列腺等脏器备用。3、常规方法称小鼠体重和前列腺湿重,通过Western Blot及免疫荧光检测MC-LR在小鼠前列腺中分布情况。4、制作前列腺石蜡切片,连续切片并H&E染色,光学显微镜下拍照,观察前列腺组织结构损伤情况;TUNEL检测前列腺组织凋亡情况。5、通过酶联免疫法检测了血清和前列腺组织裂解液中的白介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子(TNFα),酸性磷酸酶(ACP)和前列腺特异性抗原(PSA)表达变化情况。三、结果1、急性实验中,MC-LR腹腔注射雄性小鼠1天,实验组与对照组相比,小鼠体重下降,前列腺指数(前列腺与体重的比值)无显著性变化;MC-LR腹腔注射小鼠4天和7天后,体重明显下降,前列腺指数无显著性变化。慢性实验中,MC-LR染毒小鼠3个月和6个月后,实验组与对照组相比,体重净增长量明显降低;前列腺指数无显著性变化。2、Western Blot和免疫荧光实验结果表明,MC-LR能够进入前列腺组织,主要分布在前列腺腺泡壁,少量分布在基质中。3、石蜡切片后,H&E 染色发现 15 μg kg b.w.-1 day1 和 30 μg kg b.w.-1 day-1结构破坏明显,MC-LR染毒7天后,前列腺腺泡完整性被破坏,上皮细胞脱落严重,腺泡周围的纤维组织出现轻微的增生。MC-LR染毒3个月和6个月后,1 μg/L组,前列腺腺泡结构保持完整,10 μg/L、20 μg/L和30 μg/L上皮脱落较明显,腺泡上皮细胞排列紊乱,局部出现增生。TUNEL检测发现,急性实验中,前列腺组织中细胞的凋亡显著增加,并且呈现时间和剂量依赖性;与急性实验相比,慢性实验中细胞凋亡率较低。4、酶联免疫吸附法检测血清和前列腺组织裂解液中IL-6,TNFα,ACP和PSA上调。四、结论1、急性实验中,MC-LR腹腔注射雄性小鼠使得小鼠体重下降;长时期低剂量MC-LR染毒雄性小鼠,小鼠体重净增长量减少;前列腺指数无显著性变化。2、MC-LR能够进入雄性小鼠前列腺组织并且主要分布在腺泡壁。3、MC-LR可使前列腺组织结构损坏,细胞凋亡增多,并呈现时间和剂量依赖性。4、MC-LR可使小鼠血清和前列腺组织裂解液中IL-6,TNFα,ACP和PSA增加。第二部分MC-LR对前列腺上皮细胞毒性作用的研究一、目的通过MC-LR染毒正常人前列腺上皮RWPE-1细胞系,探究MC-LR对其毒性作用,初步探讨MC-LR对雄性生殖系统的毒性作用机制。二、方法1、以0,500 nM的MC-LR染毒RWPE-1细胞48小时后,利用免疫荧光检测MC-LR在前列腺上皮细胞中的分布情况。2、体外培养RWPE-1细胞系,以不同浓度(0,5,50,250,500,5000 nM)的MC-LR染毒48小时后,利用CCK-8法检测细胞活力变化。3、根据MC-LR染毒后细胞活力检测结果,以不同浓度(0,5,50,250,500,5000 nM)的MC-LR染毒RWPE-1细胞48小时后,利用FDA/PI双染技术观察细胞存活率变化。4、LDH试剂盒来检测MC-LR对细胞膜完整性的影响。5、Western Blot检测MC-LR染毒后,前列腺上皮细胞中ACP,PSA,AR,ERK1/2以及MEK的表达变化。三、结果1、免疫荧光法检测证明MC-LR染毒后能够进入人前列腺上皮RWPE-1细胞并分布在细胞核周围。2、以不同浓度的MC-LR对前列腺上皮RWPE-1细胞染毒后,利用CCK-8法检测细胞活力变化,发现250 nM,500 nM,5000 nM染毒48小时细胞活力显著下降。3、以不同浓度的MC-LR对前列腺上皮RWPE-1细胞染毒后,利用FDA/PI双染法检测细胞存活率变化,发现500 nM,5000 nM染毒48小时后细胞存活率显著下降。4、LDH试剂盒来检测MC-LR对细胞膜完整性的毒性影响发现:染毒48小时后,LDH释放率在250 nM,500 nM,5000 nM组显著升高。5、MC-LR染毒后,Western Blot检测发现,前列腺上皮细胞中ACP、PSA、AR、pERK1/2以及pMEK的表达上升。四、结论1、MC-LR染毒RWPE-1细胞后,能够进入细胞中,且主要分布在细胞核周围。2、随着MC-LR染毒浓度的增加,RWPE-1细胞活力及存活率逐渐下降;细胞膜的完整性破坏。3、在前列腺上皮细胞中,MC-LR可使ERK1/2,MEK磷酸化,激活MAPK通路,从而使得AR、PSA、ACP表达上升。本研究的特色与创新之处:1、率先研究了 MC-LR在雄性小鼠前列腺组织及人前列腺上皮RWPE-1细胞中的分布。2、率先研究腹腔注射及长期低剂量染毒MC-LR,对雄性哺乳动物特有的附属性腺前列腺的毒性作用。