芥酸是菜籽粕中的抗营养因子之一,已有研究发现其能显著降低陆生动物的生产性能。然而芥酸对水产动物生产性能的影响还未见研究报道。本研究首先通过生长试验考察芥酸对生长中期草鱼生产性能、营养物质表观消化率、肠道组织结构、血清二胺氧化酶活性、血清D-乳酸含量、肠道紧密连接、肠道粘附连接、肠道氧化损伤和肠道细胞凋亡及相关信号分子的影响,并确定生长中期草鱼饲料中芥酸的控制剂量;第二,通过体外试验,研究芥酸对草鱼肠道上皮细胞关键信号分子RhoA活性、紧密连接和粘附连接相关基因和蛋白表达的影响;第三,结合生长试验和体外试验,研究芥酸对草鱼肠道细胞超微结构和内质网应激相关蛋白的基因及蛋白表达的影响;第四,通过体外试验,研究内质网应激介导的非折叠蛋白反应途径（PERK/eIF2α、IRE1/XBP1和ATF6）在芥酸改变草鱼肠道细胞间结构完整性中的作用。主要研究内容和结果如下:1.芥酸对生长中期草鱼生产性能和肠道结构完整性的影响试验方法:选取540尾健康草鱼（129.17±0.19 g）,随机分为6个处理,每个处理3个重复。芥酸在饲料中的添加水平为:0.00、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50%（实际水平为:0.00、0.29、0.60、0.88、1.21和1.50%）。饱食投喂,4次/天,养殖周期为60天。主要研究结果如下:1.1芥酸对生长中期草鱼生产性能和肠道组织结构的影响1)随着饲料中芥酸水平的升高,生长中期草鱼的终末体重、增重百分比、特定生长率、摄食量、饲料效率、肠重和肠体指数呈现出线性（P<0.01）和二次（P<0.05）降低的变化,肠长、肠长指数、以及生长中期草鱼饲料干物质、粗脂肪和粗蛋白的表观消化率呈现出线性（P<0.01）降低的变化,前肠芥酸残留量和血清D-乳酸含量呈现出线性和二次升高的变化（P<0.01）以及中肠和后肠芥酸残留量和血清二胺氧化酶活性呈现出线性升高的变化（P<0.01）;2)与对照组相比,饲料中芥酸（≥0.88%）可引起生长中期草鱼肠道充血以及前、中和后肠绒毛组织增生;3)以增重百分比、前肠MDA含量、中肠ROS含量以及后肠PC含量为标识,采用折线回归分析,得出生长中期草鱼（129.17–471.18 g）饲料中芥酸的控制剂量分别为0.64%、0.48%、0.48%和0.53%。以上结果表明:芥酸（≥0.64%）会降低生长中期草鱼的生产性能以及改变草鱼肠道组织结构。1.2芥酸对生长中期草鱼肠道细胞结构完整性的影响1)随着饲料中芥酸水平的升高,草鱼前、中和后肠中ROS、MDA和PC含量呈现出线性（P<0.01）和二次（P<0.05）升高的变化,草鱼前肠AHR、Mn SOD、GPX和GST活性,中肠AHR、ASA、Mn SOD、CAT、GST和GR活性以及后肠GSH含量和Mn SOD、GPX、GST和GR活性呈现出线性（P<0.01）和二次（P<0.05）降低的变化,前肠GSH含量、ASA、CAT和GR活性,中肠GSH含量和GPX活性,以及后肠AHR、ASA和CAT活性呈现出线性（P<0.01）降低的变化;2)随着饲料中芥酸水平的升高,草鱼前、中和后肠中Mn SOD、CAT、GPX1a、GPX1b、GPX4a、GPX4b、GSTP1、GSTO1、GSTO2、GR、Nrf2、IAP和Mcl-1的mRNA水平以及细胞质和细胞核中的Nrf2蛋白水平呈现出线性降低的变化（P<0.01）,而keap1a、caspase-2、-7、-8、-9、Apaf-1、Bax、Fas L和p38MAPK的mRNA水平呈现出线性升高的变化（P<0.01）;3)当饲料中芥酸水平达到0.88%或更高时,草鱼三个肠段都会出现DNA片段化现象。有趣的是,饲料中芥酸水平对生长中期草鱼前、中和后肠Cu Zn SOD活性、Cu Zn SOD、GSTP2、keap1b和JNK的mRNA水平没有影响（P>0.05）。并且随着饲料中芥酸水平的升高,前肠和中肠caspase-3的mRNA水平呈现出线性升高的变化（P<0.01）,但后肠caspase-3的mRNA水平没有变化（P>0.05）,中肠Bcl-2的mRNA水平呈现出线性降低的变化（P<0.01）,而前肠和后肠Bcl-2的mRNA水平没有变化（P>0.05）。结果表明:芥酸可能会分别通过Nrf2和p38MAPK信号途径诱导草鱼肠道氧化损伤和凋亡的发生,进而破坏草鱼肠道细胞结构完整性。1.3芥酸对生长中期草鱼肠道细胞间结构完整性的影响1)随着饲料中芥酸水平的升高,生长中期草鱼前、中和后肠紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2、occludin、claudin-b、-c、-f、-3c、-7a、-7b、-11和粘附连接蛋白α-catenin、β-catenin、E-cadherin、nectin、afadin的mRNA水平以及E-cadherin、β-catenin、ZO-1的蛋白表达水平呈现出线性降低的变化（P<0.01）,同时离子通道蛋白claudin-15a和关键信号分子NMII、ROCK和MLCK的mRNA水平呈现出线性升高的变化（P<0.01）;2)随着饲料中芥酸水平的升高,草鱼前、中和后肠GTP-RhoA/Total-RhoA比值呈现出线性升高的变化（P<0.01）。有趣的是,芥酸不影响生长中期草鱼肠道离子通道蛋白claudin-15b和claudin-12的基因表达（P>0.05）。结果表明:芥酸可能会通过激活RhoA信号途径破坏草鱼肠道细胞间结构完整性。2.芥酸可通过激活RhoA信号途径破坏草鱼肠道细胞间结构完整性生长试验结果表明:芥酸可能会通过RhoA信号途径破坏草鱼肠道细胞间结构完整性,为进一步验证芥酸是否通过该信号途径破坏草鱼肠道细胞间结构完整性,开展体外试验研究了芥酸对草鱼肠细胞间紧密连接和粘附连接蛋白的影响。试验分为两部分:试验1设计6个芥酸浓度梯度（0、1、2、3、4和5 mmol/L）,每个浓度6个重复,处理草鱼肠细胞24 h,构建芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构模型,筛选培养液中的芥酸添加水平。结果表明:培养液中添加3 mmol/L或更高浓度的芥酸可显著增加草鱼肠细胞培养液中乳酸脱氢酶活性和肠细胞中MDA的含量,以及上调草鱼肠细胞间离子通道蛋白claudin-15a,和下调紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-b、JAM和粘附连接蛋白Ecadherin、α-catenin和β-catenin的mRNA水平,这说明3 mmol/L或更高浓度的芥酸能有效破坏草鱼肠细胞间结构完整性。试验2设计4个处理组,分别是:对照组（Control）、RhoA抑制剂组（Rhosin hydrochloride+）、芥酸组（EA+）和芥酸+RhoA抑制剂组（EA+Rhosin hydrochloride+）,每个处理6个重复,验证芥酸是否通过RhoA信号途径破坏草鱼肠细胞间结构完整性。主要研究结果如下:1)与对照组相比,芥酸下调草鱼肠细胞中紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-7a和claudin-7b（P<0.05）和粘附连接蛋白nectin、E-cadherin和β-catenin的mRNA水平（P<0.05）,以及下调ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时上调离子通道蛋白claudin-15a以及关键信号分子MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）,而RhoA活性抑制剂（Rhosin hydrochloride）可显著上调由芥酸下调的ZO-1、occludin、claudin-7a、claudin-7b、nectin和E-cadherin的mRNA水平（P<0.05）和ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达,同时下调由芥酸上调的claudin-15a、MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）。与此同时,RhoA活性抑制剂（Rhosin hydrochloride）有上调由芥酸下调的β-catenin的mRNA水平的趋势（P=0.072）;2)与对照组相比,芥酸显著增加草鱼肠细胞中GTPRhoA/Total-RhoA的比值（P<0.05）,而RhoA活性抑制剂（Rhosin hydrochloride）可显著下调由芥酸上调的GTP-RhoA/Total-RhoA的比值（P<0.05）。结果表明:芥酸会通过激活RhoA信号途径破坏草鱼肠道细胞间结构完整性。3.内质网应激在芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性中的作用3.1芥酸对生长中期草鱼肠道内质网应激的影响本试验通过考察芥酸对生长中期草鱼肠道细胞超微结构和肠道内质网应激关键蛋白表达的影响,探究芥酸是否引起草鱼肠道内质网应激。主要研究结果如下:1)芥酸会导致生长中期草鱼肠道细胞中内质网和线粒体出现明显的肿胀现象;2)随着饲料中芥酸水平的升高,草鱼前、中和后肠内质网应激相关指标GRP78、CHOP、eIF2α和XBP1的mRNA水平呈现出线性升高的变化（P<0.01）;3)随着饲料中芥酸水平的升高,草鱼前、中和后肠内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1和ATF6的蛋白表达呈现出线性升高的变化（P<0.01）。结果表明:芥酸可导致生长中期草鱼肠道内质网应激。3.2内质网应激在芥酸破坏草鱼肠细胞间结构完整性中的作用生长试验的结果表明:芥酸会诱导生长中期草鱼肠道内质网应激。为探究芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性这一过程是否与内质网应激的发生有关,研究了内质网应激在芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性中的作用。试验设计4个处理组,分别是:对照组（Control）、内质网应激抑制剂组（4-PBA+）、芥酸组（EA+）和芥酸+内质网应激抑制剂组（EA+4-PBA+）,每个处理6个重复。主要研究结果如下:1)与对照组相比,芥酸会导致草鱼肠细胞中内质网和线粒体出现明显的肿胀现象,而内质网应激抑制剂（4-PBA）可显著缓解由芥酸导致的草鱼肠细胞中内质网和线粒体肿胀现象的发生;2)与对照组相比,芥酸会显著上调草鱼肠细胞中内质网应激相关指标GRP78、CHOP、eIF2α和XBP1的mRNA水平（P<0.05）,而内质网应激抑制剂（4-PBA）可显著下调由芥酸上调的GRP78、CHOP、eIF2α和XBP1的mRNA水平（P<0.05）;3)与对照组相比,芥酸会显著上调草鱼肠细胞内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK、p-IRE1和ATF6的蛋白表达（P<0.05）,而内质网应激抑制剂（4-PBA）可显著下调由芥酸上调的GRP78、p-PERK、p-IRE1和ATF6的蛋白表达（P<0.05）;4)与对照组相比,芥酸会下调草鱼肠细胞中紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-7a和claudin-7b（P<0.05）,以及粘附连接蛋白nectin、E-cadherin和β-catenin的mRNA水平（P<0.05）,和下调ZO-1、Ecadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时上调离子通道蛋白claudin-15a和关键信号分子MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）,而内质网应激抑制剂（4-PBA）可显著上调由芥酸下调的ZO-1、occludin、nectin和E-cadherin的mRNA水平（P<0.05）和上调由芥酸下调的ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时下调由芥酸上调的claudin-15a、MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）。与此同时,内质网应激抑制剂（4-PBA）有上调由芥酸下调的claudin-7a（P=0.053）、claudin-7b（P=0.055）和β-catenin（P=0.087）mRNA水平的趋势;5)与对照组相比,芥酸会显著增加草鱼肠细胞中关键信号分子GTP-RhoA/Total-RhoA比值（P<0.05）,而内质网应激抑制剂（4-PBA）可显著降低由芥酸升高的GTP-RhoA/Total-RhoA比值（P<0.05）。结果表明:内质网应激参与芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性这一过程中。4.内质网应激介导的非折叠蛋白反应在芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性中的作用4.1 PERK/eIF2α信号途径在芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性中的作用本试验通过考察芥酸对草鱼肠细胞间紧密连接和粘附连接相关蛋白,以及p-PERK和eIF2α表达的影响,探究PERK/eIF2α信号途径在芥酸破坏草鱼肠细胞间结构完整性中的作用。结果显示:1)与对照组相比,芥酸下调草鱼肠细胞间紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-7a和claudin-7b（P<0.05）和粘附连接蛋白nectin、E-cadherin和β-catenin的mRNA水平（P<0.05）,以及下调草鱼肠细胞间ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时上调离子通道蛋白claudin-15a以及关键信号分子MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）,而PERK活性抑制剂（GSK2656157）可显著上调由芥酸下调的ZO-1、claudin-7a和claudin-7b的mRNA水平（P<0.05）,和上调由芥酸下调的ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时下调由芥酸上调的claudin-15a、MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）。与此同时,PERK活性抑制剂（GSK2656157）有上调由芥酸下调的nectin（P=0.067）的mRNA水平的趋势;2)与对照组相比,芥酸可显著增加草鱼肠细胞中GTP-RhoA/Total-RhoA比值（P<0.05）,而PERK活性抑制剂（GSK2656157）可显著降低由芥酸升高的GTP-RhoA/TotalRhoA比值（P<0.05）;3)与对照组相比,芥酸可显著增加草鱼肠细胞中p-PERK的蛋白表达和eIF2α的mRNA水平（P<0.05）,而PERK活性抑制剂（GSK2656157）可显著降低由芥酸升高的p-PERK的蛋白表达和eIF2αmRNA水平（P<0.05）。结果表明:PERK/eIF2α信号途径参与芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性这一过程中。4.2 IRE1/XBP1信号途径在芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性的作用本试验通过考察芥酸对草鱼肠细胞间紧密连接和粘附连接相关蛋白,以及IRE1和XBP1表达的影响,探究IRE1/XBP1信号途径在芥酸破坏草鱼肠细胞间结构完整性中的作用。结果显示:1)与对照组相比,芥酸可下调草鱼肠细胞间紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-7a和claudin-7b（P<0.05）和粘附连接蛋白nectin、E-cadherin和β-catenin的mRNA水平（P<0.05）,以及下调草鱼肠细胞间ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时上调离子通道蛋白claudin-15a以及关键信号分子MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）,而IRE1抑制剂（STF-083010）可显著上调由芥酸下调的ZO-1和nectin的mRNA水平（P<0.05）和上调由芥酸下调的ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时下调由芥酸上调的claudin-15a、MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）。并且,IRE1抑制剂（STF-083010）有上调由芥酸下调的occludin（P=0.097）、claudin-7a（P=0.071）、claudin-7b（P=0.078）和E-cadherin（P=0.082）的mRNA水平的趋势;2)与对照组相比,芥酸可显著增加草鱼肠细胞中GTP-RhoA/Total-RhoA比值（P<0.05）,而IRE1抑制剂（STF-083010）可显著降低由芥酸升高的GTP-RhoA/Total-RhoA比值（P<0.05）;3)与对照组相比,芥酸可显著增加草鱼肠细胞中p-IRE1的蛋白表达和XBP1的mRNA水平（P<0.05）,而IRE1抑制剂（STF-083010）可显著降低由芥酸升高的p-IRE1的蛋白表达和XBP1的mRNA水平（P<0.05）。结果表明:IRE1/XBP1信号途径也参与芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性这一过程中。4.3 ATF6信号途径在芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性的作用本试验通过考察芥酸对草鱼肠细胞间紧密连接和粘附连接相关蛋白,以及ATF6表达的影响,探究ATF6信号途径在芥酸破坏草鱼肠细胞间结构完整性中的作用。结果显示:1)与对照组相比,芥酸可显著下调草鱼肠细胞间紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-7a和claudin-7b（P<0.05）和粘附连接蛋白nectin、E-cadherin和β-catenin的mRNA水平（P<0.05）,以及下调草鱼肠细胞间ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,同时上调离子通道蛋白claudin-15a以及关键信号分子MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）。同时,ATF6抑制剂（AEBSF）会进一步下调由芥酸下调的ZO-1、occludin、claudin-7a、claudin-7b、nectin、E-cadherin和β-catenin的mRNA水平（P<0.05）和ZO-1、E-cadherin和β-catenin的蛋白表达（P<0.05）,以及上调由芥酸上调的claudin-15a、MLCK、NMII和ROCK的mRNA水平（P<0.05）;2)与对照组相比,芥酸可显著增加草鱼肠细胞中GTP-RhoA/Total-RhoA比值（P<0.05）,并且ATF6抑制剂（AEBSF）会进一步增加由芥酸增加的GTP-RhoA/Total-RhoA比值（P<0.05）;3)与对照组相比,芥酸可显著增加草鱼肠细胞中ATF6的蛋白表达（P<0.05）,而ATF6抑制剂（AEBSF）会显著降低由芥酸升高的ATF6的蛋白表达（P<0.05）。结果表明:ATF6信号途径不参与芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性这一过程中,同时,该信号途径可能会在一定程度上缓解由芥酸对草鱼肠细胞间结构完整性造成的破坏作用。综上所述,芥酸会降低生长中期草鱼生产性能,这可能与芥酸改变草鱼肠道结构有关,草鱼肠道结构的破坏与芥酸破坏肠道细胞结构完整性和肠道细胞间结构完整性有关;芥酸可通过RhoA信号途径破坏草鱼肠道细胞间结构完整性;内质网应激参与芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性这一过程中;内质网应激介导的非折叠蛋白反应PERK/eIF2α和IRE1/XBP1（而不是ATF6）信号途径参与芥酸破坏草鱼肠道细胞间结构完整性这一过程中。