前言铝的神经毒性作用日益引起人们的重视。已有研究发现，铝最容易引起神经元损伤，影响智力发育，且铝导致的神经系统功能障碍，是一个长期的慢性的病理过程，涉及到脑发育的各个阶段。大量研究表明，许多神经系统疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、透析综合症、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）等均与慢性铝蓄积有关。因此，对铝中毒寻找有效的预防与治疗措施具有重大的临床意义。通过对铝中毒患者进行观察发现，脑内有过量的铝蓄积时，会引起血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的结构和功能损伤。同时发现，锌对于此种损伤具有一定的保护作用，但是浓度过高反而会引起神经细胞的损伤。本研究旨在探讨不同浓度的锌对脑内铝含量的影响，以便寻找出最佳给药浓度来保护铝对脑的损伤，从而为预防慢性铝金属中毒和采取适当的治疗措施提供理论依据。材料和方法一、实验材料1．实验动物出生40天的清洁级SD大鼠300只，体重80±10g。2．主要试剂分析纯六水合氯化铝（AlCl₃·6H₂O）；硫酸锌（ZnSO₄）；伊文思蓝（Evans blue，EB）；考马斯亮蓝G250；兔抗鼠血管紧密连接相关蛋白occludin单克隆抗体；化学发光增强（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒；过氧化物酶标记的山羊抗兔二次抗体；罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色剂。3．主要仪器Morris水迷宫装置；Spectronic 21型的紫外-可见分光光度计；JEM-1200EX型透射电镜；通用电泳仪、凝胶电泳成像系统；低温冷冻离心机；正置荧光显微镜；恒温冷冻切片机。二、实验方法1、分组健康40日龄SD大鼠300只，按体重随机分到下列各实验组中，分别为：A对照组；B低铝组；C中铝组；D高铝组；E低锌组；F高锌组；G中铝+低锌组；H中铝+高锌组；I高铝+低锌组；J高铝+高锌组。2、给药腹腔注射无菌的生理盐水或低、中、高浓度AlCl₃溶液，造成铝中毒；口腔灌胃给予低、高浓度ZnSO₄溶液。每连续处理3天间歇1天，共计8个周期。3、定期检测动物体重增长情况。4、利用经典Morris水迷宫检测各组动物的学习记忆能力。5、测定脑组织EB含量来判断各组动物BBB通透性的改变。6、应用透射电镜观察脑超微结构的变化。7、免疫组化荧光染色和正置荧光显微镜观察毛细血管内皮细胞上的细胞骨架蛋白F-actin的表达情况。8、免疫组化SABC染色法观察紧密连接相关蛋白occludin的分布位置以及表达水平的变化。9、Western blot法测定紧密连接相关蛋白occludin的含量变化。10、统计分析采用SPSS13.0（statistical package for the social science，SPSS）统计分析处理软件对数据进行处理，P＜0.05视为有统计学意义。实验结果一、各组动物体重增长情况对照组大鼠体重增长值（115.6±4.8g）与中铝组（82.4±22.2g）、高铝组（55.8±6.80g）相比均具有统计学差异，P＜0.05；中铝组（82.4±22.2g）与中铝+低锌组（108.8±12.4g）、中铝+高锌组（107.0±9.59g）相比均具有显著差异，P＜0.01；高铝组（55.8±6.80g）与高铝+低锌组（93.0±4.47g）、高铝+高锌组（105.0±10.0g）相比均具有显著差异，P＜0.01。二、Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力各组之间的大鼠逃避潜伏期和空间定位航行实验结果无统计学差异，P＞0.05。三、BBB通透性的变化对照组的脑组织EB含量（0.011±0.003μg／g脑重量）与低铝组（0.053±0.007μg／g脑重量）、中铝组（0.085±0.012μg／g脑重量）、高铝组（0.110±0.021μg／g脑重量）相比均具有显著差异，P＜0.01；中铝组（0.085±0.012μg／g脑重量）与中铝+低锌组（0.036±0.004μg／g脑重量）、中铝+高锌组（0.031±0.002μg／g脑重量）相比均具有显著差异，P＜0.01；高铝组（0.110±0.021μg／g脑重量）与高铝+低锌组（0.061±0.003μg／g脑重量）、高铝+高锌组（0.042±0.006μg／g脑重量）相比均具有显著性差异，P＜0.01。四、透射电镜观察脑超微结构的变化电镜结果显示，对照组动物脑BBB紧密连接结构完整，内皮细胞核近似圆形、核膜清晰，染色质，线粒体、高尔基体等均具有完整结构；中铝、高铝组大鼠脑内皮细胞核出现不同程度的变形，线粒体和高尔基体偶有水肿，高铝组伴有异染色质向细胞核膜的边集，内皮细胞间的紧密连接模糊，电子密度高；中铝+低锌组、中铝+高锌组、高铝+高锌组动物脑BBB的超微结构保持较完整，功能较正常，但也偶有内皮细胞核的轻微分裂，紧密连接开放。五、免疫组织化学荧光染色观察微细血管内皮细胞上的骨架蛋白F-actin的表达在荧光显微镜下，对照组动物脑内皮细胞骨架蛋白F-actin呈红色丝状，沿血管壁均匀表达；中铝组、高铝组动物脑内的微血管的F-actin表达模糊，有不连接的现象，可见血管壁有不同程度的皱缩、变形；低铝组、低锌组、中铝+高锌组脑微血管较为规则，丝状F-actin沿血管壁均匀表达，连续、明亮、清晰。六、免疫组化SABC染色法观察紧密连接相关蛋白occludin的分布位置以及表达水平的变化组织化学研究结果显示，occludin表达于内皮细胞毗邻处，呈点状和线状表达；对照组大鼠微血管内皮细胞间紧密连接相关蛋白occludin表达的平均光密度值（0.255±0.010）与中铝组（0.219±0.008）、高铝组（0.207±0.004）相比均具有显著差异，P＜0.05；中铝组（0.219±0.008）与中铝+低锌组（0.236±0.005）、中铝+高锌组（0.250±0.004）相比均具有显著差异，P＜0.01；高铝组与高铝+低锌组（0.229±0.003）、高铝+高锌组（0.242±0.003）相比均有显著差异，P＜0.01。七、Western blot法测紧密连接相关蛋白occludin的含量变化中铝组大鼠脑组织中occludin（62-80KD）的相对光密度值（0.585±0.012）和对照组（0.701±0.048）、中铝+高锌组（0.661±0.004）相比均具有显著差异，P＜0.01；高铝组（0.427±0.003）与高铝+低锌组（0.565±0.003）、高铝+高锌组（0.678±0.014）相比，均具有显著差异，P＜0.01。讨论BBB对于保持中枢神经系统的稳定起重要作用，也是铝对神经元产生损伤作用的门户。过量铝接触导致的学习记忆等方面的功能障碍，是一个长期慢性神经病理过程并涉及脑发育的各个阶段。本研究所选的动物为出生40天的未成年SD大鼠，染毒期为32天，这与以往实验所选择的动物年龄和染毒时间不同。本研究的水迷宫结果提示，短期低浓度的铝并未对动物学习记忆方面造成明显的影响，由此再次证明了铝导致学习记忆方面功能障碍的长期慢性毒性作用。BBB保持着中枢神经系统内环境的稳定，而内皮细胞之间的紧密连接是保持内环境稳定的主要结构之一。透射电镜、免疫组织化学分析和western blot检测结果表明：各染毒组动物BBB超微结构和通透性与正常组相比均有所变化，铝对组成BBB的各部分细胞的膜结构和内皮细胞的线粒体和高尔基体都有所损伤，并且导致了紧密连接相关蛋白occludin表达的减少及F-actin表达的改变、局部BBB的开放，而且随着铝染毒剂量的增加，BBB通透性逐渐增加。锌是人体必需的微量元素之一，参与体内多种酶和功能蛋白的组成，影响细胞增殖、分化，参与核酸、蛋白质的代谢，维持正常的细胞周期，增强机体免疫力。本研究结果表明，适当浓度的锌对铝导致的未成年大鼠BBB的完整性的破坏具有一定的保护作用，可以缓解铝引起的BBB结构的改变和通透性的升高；本研究的免疫组织化学染色和western blot结果首次证明：铝影响了大鼠BBB内皮细胞间紧密连接相关蛋白occludin的表达，而且随着铝染毒剂量的增加，occludin的表达显著减少。免疫组织化学荧光染色结果表明：过量铝接触影响BBB的细胞骨架蛋白F-actin的表达。上述结果提示occludin表达的减少及F-actin表达的改变可能是铝导致BBB通透性升高的直接原因之一。锌虽然具有广泛的生理生化功能，但是过高浓度和盲目的使用也会影响正常的生理功能，本研究所选择的高锌组动物的BBB的结构和功能与对照组相比有明显差异，可以推测，本研究中的高浓度锌可以逆转铝导致的未成年大鼠BBB的通透性的升高，保持BBB正常的超微结构，稳定紧密连接相关蛋白的表达，可以考虑用来作为某种病理条件下的治疗用量，但高浓度锌不适宜作为正常生理条件下的日常膳食补充。紧密连接相关蛋白occludin和F-actin的变化提示铝的毒性作用可能与其改变BBB的通透性和完整性相关，这可能是铝对中枢神经系统的初步损伤，这些损伤的长期积累可能诱导产生神经元的病理改变，但长期铝接触导致BBB的变化以及BBB的变化与神经元病理变化的相关性还有待进一步的研究。未成年动物具有BBB结构和功能发育不完善等特点，与成年动物相比更易受到损伤和破坏，且损伤程度会更大，波及范围更广。因此，继续研究锌对铝接触导致的中枢神经毒性作用的保护作用，可能对未成年动物的铝接触寻找出更有效的拮抗剂，同时可能为铝中毒提供新的防护途径。结论1．小于10mg／kg浓度的铝接触显著降低了未成年SD大鼠的体重增长，但未对大鼠的学习记忆能力产生明显的影响。2．2.5mg／kg浓度的铝增加了未成年大鼠BBB的通透性；大于5mg／kg浓度的铝接触增加了BBB的通透性，损伤了血管内皮细胞的超微结构，显著降低了紧密连接相关蛋白occludin的表达，改变了F-actin的表达。3．5mg／kg的锌未对未成年动物体重、BBB的通透性和超微结构产生明显的影响；10mg／kg的锌显著降低了未成年SD大鼠的体重增长，增加了BBB的通透性，损伤了血管内皮细胞的超微结构，且影响了occludin和F-actin的表达。4．锌对铝接触导致的未成年大鼠体重增长缓慢具有显著的改善作用。锌对铝接触导致的未成年大鼠BBB的通透性的增加和超微结构的破坏具有明显的保护作用，锌显著抑制了紧密连接相关蛋白occludin和F-actin的表达改变。