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温度信号可以调节植物的休眠状态及冷驯化,是其冬季生存的决定因素。CBF转录因子家族介导的低温信号就是很好的研究机制之一。降温后,CBFs转录诱导迅速发生,随后其靶基因(CBF调节子)的表达量增加,CBFs在冷驯化过程中发挥重要的作用。本研究从新疆栽培扁桃中分离得到了AcCBF1转录因子基因,并对其进行了序列分析及功能验证,主要研究结果如下: 1.从新疆栽培扁桃不同品种中克隆得到开放阅读框为729 bp的CBF1基因(GenBank登录号:KJ818900、KM245570和KM245571)命名为AcCBF1。对其进行生物信息学分析,其分子式为C1195H1886N346O368S13,编码27.405 kD蛋白质,理论等电点为7.69,半衰期为30 h。其脂肪系数为63.72,疏水性平均值为-0.646。不存在跨膜结构,是一种非分泌性亲水蛋白。二级结构预测结果显示该蛋白主要由26.86%的α螺旋、2.89%的β转角和58.68%的无规卷曲组成。通过蛋白质同源三维结构建模可推测出AcCBF1也可通过其AP2结构域结合双链DNA。 2.通过qRT-PCR技术分析了AcCBF1转录因子在不同非生物逆境胁迫下的表达模式。试验结果表明,扁桃AcCBF1转录因子对低温、干旱、盐及ABA胁迫均有表达。其中,受低温及干旱胁迫的诱导比较强烈,对盐及ABA也有不同程度的响应。 3.将AcCBF1基因插入到酵母单杂载体pGBKT7中,转录激活活性分析表明,AcCBF1基因具有特异结合DRE元件的活性和转录激活下游基因表达的功能。 4.构建pCAMBIA1304-AcCBF1融合表达载体,通过农杆菌浸染洋葱表皮细胞,对AcCBF1蛋白进行亚细胞定位分析。结果表明在洋葱表皮细胞核内能检测到绿色荧光蛋白,说明AcCBF1转录因子可定位于细胞核内。 5.将AcCBF1转录因子构建到原核表达载体pET-32a(+)中,由于His-Tag的融合表达,在大肠杆菌(ED3)中成功表达了大约为48 KD的蛋白质。对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果表明,重组蛋白pET-AcCBF1在IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导4h时,其表达量最佳。 6.将含有pCAMBIA1304-AcCBF1融合质粒的农杆菌注射到烟草叶片,通过检测GUS酶活来检测AcCBF1基因在真核生物中的瞬时表达情况。试验结果表明导入了外源基因AcCBF1的烟草叶片中出现了明显的蓝色物质,说明AcCBF1基因能在烟草叶片中正常表达。 7.将AcCBF1基因构建到pCAMBIA1303过表达载体上,通过花序浸染法,转入模式植物拟南芥中。对其进行PCR及GUS组织染色检测后证实外源基因AcCBF1已经成功转入拟南芥基因组中。对转基因拟南芥进行非生物逆境胁迫下表型观察,结果表明AcCBF1基因在拟南芥中的过表达增强了其对非生物逆境胁迫的耐受性。