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肝纤维化是不同的急慢性肝损伤后的愈合反应,也是肝损伤发展至肝硬化的中间环节。早期的肝纤维化是一种可逆性病变,若未得到及时治疗,发展至后期将逐渐变为肝硬化,疾病不可逆转。金银花（Lonicerae Japonicae Flos,FL）是我国传统清热解毒中草药,实验室前期研究发现FL可以改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤,同时金银花中的主要活性成分绿原酸（Chlorogenic acid,CGA）通过抗炎,抗氧化对药物性肝损伤以及肝窦阻塞综合征都具有明显的改善作用。目的:本论文首先想要明确FL及其主要活性成分CGA缓解肝纤维化的药效作用,其次主要从抑制肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）激活、抗炎、抗氧化、抑制血管表型转换等多角度、多方面揭示FL及CGA发挥抗肝纤维化作用的机制。通过我们的实验为FL及CGA在防治肝纤维化中的应用提供实验依据,也为肝纤维化的临床治疗提供新思路。方法:1.FL抑制CCl4诱导的肝纤维化动物实验:以四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）（2 m L/kg）诱导小鼠形成肝纤维化,并给予不同剂量FL（0.2,0.4 g/kg）。采用天狼星红（Sirius Red）和马松三色（Masson’s trichrome staining,Masson）染色观察肝组织中胶原沉积情况;比色法测定肝脏羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）含量;酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清IV型胶原（collagen IV,COLIV）含量;苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,H＆E）观察肝脏的损伤情况。测定肝组织中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）和蛋白羰基化（protein carbonylation）的含量以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性。采用实时荧光定量PCR（Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR）检测纤黏连蛋白1（Fibronectin1,Fn1）、I型胶原α1（Collagen I alpha 1,Col1a1）、III型胶原α1（Collagen III alpha 1,Col3a1）、α-平滑肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）,以及核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）及其下游调控分子的m RNA表达;蛋白免疫印迹法（western-blot,WB）检测α-SMA蛋白的表达,Nrf2的核转录激活及其下游调控分子的蛋白表达;免疫荧光实验检测α-SMA蛋白的表达。2.FL抑制蛋氨酸/胆碱缺乏饲料（methionine-choline deficient diet,MCD）诱导的肝纤维化动物实验:以MCD诱导小鼠形成肝纤维化,并给予不同剂量FL（0.2,0.4g/kg）。采用H＆E观察肝脏的损伤情况;Masson和Sirius Red染色观察肝组织中胶原沉积情况;比色法测定肝脏羟脯氨酸HYP含量;Real-time PCR测定小鼠纤维化相关分子Col1a1、Col3a1、Fn1、TGF-β和α-SMA的m RNA表达;Western-blot测定α-SMA的蛋白表达。3.FL中主要活性成分在体外抑制HSC激活的研究:不同浓度的CGA（1,5,10μM）,咖啡酸（Caffeic acid,CA）（1,5,10μM）以及木犀草苷（1,5,10μM）与LX-2细胞孵育24 h后,采用Real-time PCR检测细胞中Col1a1,Col3a1和α-SMA的m RNA表达。4.CGA抑制MCD诱导的肝纤维化动物实验:以MCD诱导小鼠形成肝纤维化,并给予不同剂量CGA（30,60 mg/kg）。采用H＆E观察肝脏的损伤情况;Masson和Sirius Red染色观察肝组织中胶原沉积情况;比色法测定肝脏HYP含量;ELISA测定血清中COLIV和透明质酸（Hyaluronic acid,HA）含量;Real-time PCR测定Col1a1、Col3a1、TGF-β、α-SMA和HMGB1的m RNA表达;Western-blot测定肝脏中α-SMA、血清中高速迁移率族蛋白1（High-mobility group box 1,HMGB1）以及肝脏血管部分α-SMA、波形蛋白（vimentin,vim）和结蛋白（desmin）的蛋白表达。5.CGA抑制LX-2细胞活化实验:LX-2与不同浓度的CGA（1,5,10μM）共同孵育24 h后,检测细胞内α-SMA蛋白表达和Smad2/3的磷酸化激活。LX-2细胞先与TGF-β（10 ng/m L）孵育12 h后,再给与不同浓度的CGA（1,5,10μM）共同孵育24 h,检测细胞内α-SMA蛋白表达和Smad2/3的磷酸化激活。6.CGA抑制HMGB1诱导血管内皮细胞表型转化的实验:人肝窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）或人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）先与HMGB1（10 ng/m L）孵育12 h后,再给与不同浓度的CGA（1,5,10μM）共同孵育12 h,检测细胞内α-SMA、vim和结蛋白的蛋白表达。结果:1.FL可以显著降低CCl4诱导肝纤维化小鼠肝组织中HYP和血清中COLIV含量的升高,减少肝组织中纤维化相关分子m RNA表达的升高以及肝脏中纤维胶原的沉积。FL还可以抑制肝脏中HSC激活,减轻肝脏氧化应激损伤,并增强Nrf2抗氧化信号通路的激活及其下游抗氧化分子的表达。2.FL可以显著降低MCD诱导肝纤维化小鼠肝组织中HYP和纤维化相关分子m RNA表达的升高,减少肝脏中纤维胶原沉积,并抑制HSC的激活。3.FL中主要活性成分在体外抑制HSC激活的研究发现:CGA（1,5,10μM）和CA（5,10μM）都可以降低LX-2细胞中Col1a1,Col3a1和α-SMA的m RNA表达,但是各浓度的木犀草苷则均无明显的降低作用。4.CGA可以显著降低MCD诱导肝纤维化小鼠肝组织中HYP和纤维化相关分子m RNA表达的升高,降低肝脏中纤维胶原沉积,抑制HSC激活,减少血清中HMGB1含量以及肝脏血管部分ECM蛋白的产生。5.体外LX-2细胞上实验结果显示,CGA（10μM）下调了LX-2中α-SMA蛋白表达和Smad2/3的磷酸化激活,还能减少TGF-β（10 ng/m L）刺激LX-2细胞诱导升高的α-SMA蛋白以及Smad2/3磷酸化激活。6.CGA可以显著降低HMGB1（10 ng/m L）刺激LSECs和HUVECs后所导致的细胞内ECM蛋白如α-SMA,vim和结蛋白表达的增加。结论:1.FL可以通过抑制肝脏HSC活化,减少肝组织中纤维胶原沉积;同时还可以通过促进Nrf2抗氧化信号通路的激活缓解氧应激肝损伤,发挥了改善CCl4和MCD诱导小鼠肝纤维化的药效作用。2.FL中的主要活性成分CGA可以通过抑制肝脏HSC活化;降低血清中升高的HMGB1水平,并抑制HMGB1介导的血管内皮表型转化,减少血管内皮中ECM蛋白的产生;从而减轻了肝脏中纤维胶原的沉积,发挥了改善MCD诱导小鼠肝纤维化的药效作用。