低聚壳聚糖对大肠杆菌感染仔猪肠道屏障的保护作用及其机制研究

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断奶仔猪由于自身免疫系统尚未发育成熟,且受到多种应激的影响,易遭受各种病原菌感染,导致肠道屏障损伤,降低生产性能。在“限抗禁抗”的背景下,如何通过非抗生素手段确保断奶仔猪肠道健康是当前畜牧业面临的重大问题。功能性低聚糖是一种潜在的抗生素替代品,具有增强动物免疫力、调节肠道菌群和维持肠道健康的功能。低聚壳聚糖(Low-molecular-weight-chitosan,LMWC)是壳聚糖经脱乙酰得到的一类功能性低聚糖,具有安全高效、理化性质稳定、功能多样等特点。虽然LMWC已在动物生产上得到应用,但其对病原微生物感染下仔猪生长性能和肠道健康的影响鲜有报道。因此,本研究以产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染仔猪为模型,研究LMWC对病原微生物感染仔猪肠道屏障的保护作用,并通过体外试验初步探讨LMWC缓解肠道屏障损伤的机制。试验一LMWC对ETEC感染仔猪生长性能、免疫功能和肠道屏障的影响选取32头21日龄、初始体重6.59(±0.13)kg的―杜×长×大‖三元杂交仔猪,均分为4组(每组8个重复):对照组(基础饲粮,CON)、ETEC感染组(基础饲粮+ETEC)、ECL50组(基础饲粮+ETEC+50 mg/kg LMWC)和ECL100组(基础饲粮+ETEC+100mg/kg LMWC)。试验第12天,除CON组仔猪灌服100 m L无菌培养基,其余各组仔猪均灌服等量ETEC菌液(2.6×109 CFU/m L)。试验第15天,所有仔猪灌服D-木糖(0.1g/kg体重),1小时后采集血清和肠道样品。结果表明:(1)与CON组相比,ETEC感染显著降低仔猪的ADG和G/F(P<0.05),饲粮中添加100 mg/kg LMWC可显著缓解ETEC感染仔猪ADG的下降(P<0.05)。(2)ETEC感染显著增加了血清中TNF-α、Ig G和Ig M的浓度,显著降低血清D-木糖水平,提高血清DAO活性、D-乳酸和LPS含量(P<0.05);而饲粮中添加50 mg/kg和100 mg/kg LMWC降低了血清中TNF-α和Ig G的浓度(P<0.05);同时100 mg/kg LMWC还降低了血清中DAO活性、Ig M、D-乳酸和LPS含量,提高了血清D-木糖水平(P<0.05)。(3)ETEC感染导致仔猪肠道屏障结构和功能损伤,表现为空肠和回肠绒毛高度与绒隐比降低,十二指肠蔗糖酶活性、空肠蔗糖酶和麦芽糖酶及回肠蔗糖酶活性降低,空肠和回肠养分转运基因(Pep T1,DMT1和Zn T1)及紧密连接蛋白(Occludin)表达下降,空肠和回肠上皮细胞凋亡率增加以及回肠、盲肠和结肠大肠杆菌的数量增加,回肠芽孢杆菌以及盲肠和结肠双歧杆菌的数量降低(P<0.05);而饲粮中添加50 mg/kg或100 mg/kg LMWC可缓解ETEC感染对仔猪肠道屏障结构和功能的损伤(P<0.05)。(4)ETEC感染增加了仔猪空肠和回肠黏膜炎性细胞因子(IL-6、TNF-α)和回肠Tryptase含量,上调了空肠和回肠炎症信号通路关键分子基因(TLR4、My D88)以及细胞核NF-κB p65蛋白表达(P<0.05);而饲粮中添加50 mg/kg或100 mg/kg LMWC可减少空肠和回肠黏膜炎性因子(IL-6、TNF-α)及炎症应答关键信号分子(TLR4、My D88和核NF-κB p65)表达(P<0.05),降低回肠Tryptase含量(P<0.05)。上述结果表明:饲粮中添加LMWC可改善ETEC感染仔猪生长性能,并通过维护肠道形态和结构的完整性,降低肠黏膜炎症细胞因子分泌,减少肠黏膜上皮细胞凋亡,缓解肠道屏障炎性损伤。试验二LMWC通过抑制NF-κB信号通路缓解LPS诱导的IPEC-J2细胞损伤试验一发现ETEC感染可引起NF-κB活化,提示NF-κB信号通路在ETEC引起的肠道屏障炎性损伤中发挥重要作用。然而,LMWC是否通过抑制NF-κB信号通路缓解肠道屏障炎性损伤尚不清楚。因此,本试验利用LPS构建的体外细胞炎症模型,模拟断奶仔猪肠道损伤,探讨LMWC缓解肠上皮炎性损伤的机制。试验分为四个处理组,即对照组(CON)、LMWC处理组(400μg/m L LMWC)、LPS处理组(5μg/m L LPS)、LMWC+LPS处理组(400μg/m L LMWC+5μg/m L LPS),先用LMWC预处理IPEC-J2细胞2 h,再用LPS处理细胞6 h。结果表明:(1)LPS刺激导致细胞中紧密连接蛋白Occludin含量降低,炎性细胞因子(IL-1、TNF-α和IFN-γ)的分泌增加(P<0.05);但添加LMWC可增加LPS诱导的IPEC-J2细胞紧密连接蛋白Occludin的含量并降低TNF-α的分泌(P<0.05)。(2)LPS刺激显著提高细胞凋亡率、上调细胞凋亡相关基因(Bid和TRADD)表达水平及cleaved caspase-3、-8、-9的含量(P<0.05);而添加LMWC可显著减少细胞凋亡率,下调TRADD基因表达水平,并降低cleaved caspase-3、-8含量(P<0.05)。(3)LPS刺激促进细胞IκBα磷酸化,显著提高细胞核和细胞质NF-κB p65蛋白水平(P<0.05);而添加LMWC可显著降低细胞IκBα磷酸化水平及细胞核和细胞质NF-κB p65蛋白水平(P<0.05)。以上结果表明:LMWC可以通过抑制NF-κB活化,减少炎性细胞因子分泌和细胞凋亡,从而缓解肠上皮细胞炎性损伤。综上所述,饲粮中添加LMWC可改善ETEC感染仔猪的生产性能和肠道屏障功能。LMWC对仔猪肠道上皮屏障的保护作用与其抑制炎症信号通路关键分子IκBα和NF-κB的活化、降低肠上皮细胞炎性因子分泌、减少上皮细胞凋亡有关。
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