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目的:
骨质疏松症的流行病学特征和与之相关的骨折的发病率迫切需要新的预防措施和治疗方法。人们已经普遍接受雌激素在骨的生长以及维持骨的动态平衡中起重要作用,但是卵巢功能衰退是多种卵巢激素同时减少或缺乏的状态。Activin是TGF-β(transforming growth factor,TGF)超家族成员,最初是从卵泡液中分离出来的内分泌因子,具有广泛的作用。ActivinA能促进小鼠卵巢颗粒细胞表达雌激素受体(estrogen receptor,ER),卵巢内activin与雌激素间存在反馈调节以维持两者表达水平和作用的平衡。ActivinA和雌激素在骨的动态平衡中是否存在相互作用及其机制,目前尚不清楚。本研究检测了activin A和17β-雌二醇(estradial,E2)在成骨诱导和非诱导条件下对胎儿骨髓基质细胞(fetal bone marrow stromal cells,fBMSCs)的增殖能力的影响,以及activin A和E2对fBMSCs成骨能力的影响;探讨了activin A和E2与ER蛋白表达的关系;并从形态学的角度检测了ER的表达和定位;初步探讨了activin A对NHERF1(Na+/H+exchange regulatory factor 1,NHERF1)蛋白表达的作用及NHERF1对fBMSCs早期成骨分化的影响;应用卵巢细胞微囊移植在体研究activin和雌激素对小鼠骨代谢的调节作用。本研究的目的是为进一步阐明activin A在成骨形成过程中的作用及其机制提供新的视点,以期找到新的可行的预防和治疗骨质疏松症的作用靶点。
材料和方法:
1、本实验采用全骨髓法对胎儿骨髓细胞进行分离、培养、扩增,通过一般生物学特性观察,流式细胞仪检测细胞表面抗原,以及细胞向成骨方向和成脂方向分化的潜能鉴定骨髓基质细胞。
2、选用第3～5代胎儿骨髓基质细胞研究activinA对胎儿骨髓基质细胞成骨诱导分化的作用及作用机制。实验选用活性碳处理的胎牛血清(fetal bovine scrum charcoal stripped),无酚红的a-MEM培养基,处理前培养3天,以减少研究以外的类固醇物质的干扰。
3、采用MTT法连续7天测细胞490nm波长OD值,观察fBMSCs在成骨诱导和非诱导条件下,用activin A、E2干预,细胞的增殖情况。
4、对fBMSCs进行成骨诱导,并进行不同的干预,经BCIP/NBT(5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate,BCIP/Nitroblue tetrazolium,NBT)法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Von-Kossal染色显示矿化结节,Van Gieson染色显示Ⅰ型胶原。
5、采用Western blot检测4小时、12小时、24小时不同干预fBMSCsERa、ERβ蛋白表达。检测fBMSCs在成骨诱导条件下不同干预ERa、ERβ蛋白表达。
6、应用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察不同干预下fBMSCsERa、ERβ蛋白的表达和定位。
7、采用Western blot检测activin A对NHERF1蛋白表达的影响,用NHERF1RNA干扰,观察activinA对NHERF1蛋白表达的影响;用BCIP/NBT法检测同条件下碱性磷酸酶活性,以探究NHERF1与fBMSCs早期成骨分化的关系。
8、选择6周龄雌性小鼠(此时的卵巢细胞即可分泌雌激素也可分泌大量的activin A)取卵巢组织,进行分离、培养卵巢细胞。将传1～2代的卵巢细胞制成卵巢细胞微囊。将小鼠分为正常组、去卵巢组和移植组,应用卵巢细胞微囊移植在体研究activin和雌激素对小鼠骨代谢的影响。用HE染色、Van Gieson染色和骨组织形态计量学测定比较三组小鼠胫骨上段骨组织结构变化,用股骨三点弯曲试验和腰椎体压缩试验检测三组小鼠股骨和第5腰椎体的骨生物力学变化。
结果:
1、通过一般生物学特性观察,流式细胞仪检测鉴定表面抗原,以及鉴定细胞向成骨方向和成脂方向分化潜能,结果符合人骨髓基质细胞的基本标准。
2、MTT法检测显示:activin A、E2在两种条件下均能促进fBMSCs增殖,但作用缓慢;细胞增殖在成骨诱导条件下比非诱导条件下慢。
3、activin A+E2组诱导18天形成矿化结节,而且形成的矿化结节较大,结构比较致密。单独用activin A、E2组和Control组在成骨诱导23天形成矿化结节,三组之间无明显差异。
4、Western blot检测结果显示activin A能促进fBMSCsERβ蛋白表达,并随时间的延长表达量增加,这种表达可以被activin A的天然阻滞剂follistatin阻断。ERa蛋白未见表达。E2刺激ERβ蛋白表达的作用较为缓慢,并且相对较弱。未见ERa蛋白条带。
5、用Western blot检测成骨诱导条件下不同处理细胞的ERa、ERβ蛋白表达,结果显示在成骨诱导条件下,activin A促进细胞ERβ蛋白表达,这种表达可以被activinA的天然阻滞剂follistatin阻断。E2能促进ERβ蛋白表达,并随着E2浓度的增高,ERβ蛋白表达量增加。ERa蛋白在增加activin A剂量至50ng/ml时,表达量显著增加。
6、用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察不同干预fBMSCsER的变化,结果显示ERB的荧光强于ERa;ERa的荧光染色核内、核外都有显示,以核内为主,而且显示多数细胞有荧光染色;ERβ的荧光定位于核内,只在fBMSCs中某类细胞表达;activin A能促进ERa、ERβ的表达,但作用相对缓慢,24小时时显示较强荧光;E2能迅速引起ERa的重新分布。
7、用Western blot检测显示activinA能增加NHERF1蛋白表达,用NHERF1siRNA转染后,activin A的促进作用下降;用BCIP/NBT法检测同条件下碱性磷酸酶活性,结果显示NHERF1蛋白表达增高,碱性磷酸酶活性也增高;NHERF1RNA干扰后,NHERF1蛋白表达下降,碱性磷酸酶活性也下降。
8、经放射免疫分析法测定卵巢细胞微囊培养液内E2和孕酮的含量与同期体外培养的卵巢细胞相比没有明显差异:卵巢细胞微囊移植90天,测定血清E2水平,结果显示移植组与正常组之间无明显差异,去卵巢组与正常组之间有显著差异。胫骨组织形态计量学结果显示,去卵巢组小鼠骨小梁体积和厚度、节点末端比明显低于对照组,小梁间距显著高于对照组,移植组和对照组间无显著差异。小鼠股骨中段三点弯曲试验结果显示,去卵巢组、移植组股骨生物力学参数与对照组比较无明显差异。腰椎体压缩试验显示,去卵巢组小鼠腰椎体破坏载荷、最大能量吸收明显下降,弹性模量也低于对照组,移植组与对照组之间没有差异。
结论:
1、activin A、E2在成骨诱导和非诱导条件下均能促进细胞增殖,但作用缓慢;成骨诱导条件下细胞增殖减慢可能与部分细胞分化,增殖能力下降有关。
2、activin A、E2都能促进成骨细胞形成,activin A的作用更强。两者同时应用不仅促进成骨细胞的形成,更有利于成骨细胞介导的骨基质的矿化。
3、activin A促进成骨诱导和非诱导条件下fBMSCsERβ蛋白表达,并随时间的延长表达量增加。E2对ERβ蛋白表达的刺激作用相对缓慢而且较弱,高浓度E2增加ERβ蛋白表达。activin A和E2有协同的作用。
4、两种ER受体亚型分布不同,可能发挥不同的作用。Activin A促进ER的表达,E2刺激存在于质膜上的受体Era迅速迁移。
5、activin A通过增加ERa蛋白表达促进NHERF1蛋白表达,从而促进成骨细胞的形成,且作用是特异的。
6、应用卵巢细胞微囊移植在体研究activin和雌激素对小鼠骨代谢的作用证实,卵巢细胞微囊移植可以促进骨形成,增加骨强度,有效地预防去卵巢引起的骨质疏松,为activin与雌激素在体内的协同作用提供了佐证。
综上所述,activin A能促进成骨细胞的形成,且与E2之间有协同作用,两者同时应用能加速成骨细胞成熟和骨基质的矿化。可能的机制之一是:activinA促进。ER表达,ERa进而促进NHERF1蛋白表达,NHERF1不仅促进细胞增殖,而且为E2提供更多的结合位点ERE,有利于E2通过经典通路发挥作用。