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目的:岩藻糖化糖胺聚糖(fucosylated glycosaminoglycan,FG)是从海参中提取的一类具有新颖结构的糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)衍生物,.由D-葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid or glucuronosyl,D-GlcA)、D-N-乙酰.氨基半乳糖(D-N-acetyl galactosamine,D-GalNAc)、L-岩藻糖(L-Fucose,L-Fuc)和硫酸酯基组成的分支’杂多糖。天然FG具有强效的内源性因子X酶复合物(Coagulant factor Ⅸa-Ⅷa complex,Fxase)抑制活性,得到了研究者的广泛关注,但是,它同时还具有凝血因子Ⅻ(Coagulant factor Ⅻ,FXⅫ)和血小板的激活活性,这使得天然FG的应用受到限制。近几年,糖苷键选择性的解聚技术应用于天然FG的结构研究中,使得部分海参品种的FG结构(只有一种硫酸取代支链)研究取得较大进展,而具有复杂硫酸取代支链的FG精确结构研究还未突破。而FG的活性亦受结构特征的影响,如Fuc支链的硫酸化形式和分子质量。准确的结构分析是研究其药理机制和结构-活性关系的基础,也是进一步探索其应用价值的基础。使用糖苷键选择性的化学解聚方法解聚FG,分析结构确切的寡糖,是研究天然FG精确结构的可靠途径。因此,本文采用糖苷键选择性的脱乙酰脱氨基解聚法,分别研究了硫酸岩藻糖侧链取代更为复杂的刺(辽)参(Apostichopusjaponicus和佛州海参(HolotouriaflorAstoana)来源FG(AjFG和HfFG)的化学结构,通过分析经解聚具有高度规律性结构的寡糖,推导出原型AjFG和HfFG的精确结构,为复杂FG的确切结构的研究提供参考;同时分析这些选择性解聚片段的抗凝血活性,包括其抑制FXase活性及其副作用(对FⅫ和血小板的作用),为海参来源新型抗凝血药物的研发奠定基础。方法:通过酶解-碱解法对辽参和佛州海参多糖进行提取,等电点去除蛋白质,醇沉去除小分子及脂溶性杂质,过氧化氢法脱去色素,阴离子交换色谱,凝胶柱色谱分离纯化等步骤,得到了 AjFG、HfFG高纯度样品;高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)分析多糖的纯度及分子量大小,电导法分析硫酸羧酸摩尔比,1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(l-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone,PMP)衍生化-HPLC法进行单糖组成分析,测定旋光度,利用红外吸收光谱(Infrared spectroscopy,IR)和核磁共振氢谱(1H Nuclear magnetic resonance,l NMR)分析其基本组成;采用糖苷键选择性的脱乙酰脱氨基解聚法解聚AjFG及HfFG,继而通过凝胶柱层析法分离它们具有不同分子量的规则寡糖片段,1D、2D NMR及ESI-Q-TOF-MS 谱图分析Fr-l-Fr-4(AjFG的寡糖片段)、dp-3-dp-9(HfFG的寡糖片段)的结构,推导AjFG及HfFG的确切结构;采用体外方法检测AjFG、dAjFG及Fr-l-Fr-4延长活化部分凝血活酶时间(Activated partial thromboplastin time,APTT)的活性,以及对FXase、因子FⅫ和血小板的影响。结果:AjFG结构分析:纯净AjFG的得率为0.3%;分子量为76.4 kDa;-OSO3-/-COO-摩尔比为3.59;AjFG由三种单糖组成,GlcA:Ga1NAc:Fuc摩尔比约1:0.94:1.07;比旋光度-68°,为左旋物质;1D/2D NMR和ESI-MS光谱分析表明,Fr-1含有两个三糖化合物的结构为L-FucS-α1,3-D-GlcA-β1,3-LD-anTa1-dio14S6S(FucS 分别为 Fuc2S4S和 Fuc3S4S),两个化合物的摩尔比约为 2:1;Fr-2 的化学结构为L-FucS-α1,3-D-G1cA-β1,3-D-Ga1NAc4S6S-β1,4-[L-FucS-α1,3-]D-G1cA-β1,3-LD-an Tal-diol46s,其中FucS存在三种硫酸酯化类型,即Ⅰ型(Fuc2S4S～51%)、Ⅱ型(Fuc3S4S～30%)和 Ⅲ 型(Fuc4S～19%);Fr-3 和 Fr-4 的化学结构为L-FucS-α1,3-D-G1cA-β1,3-{D-Ga1NAc4S6S-β1,4-[L-FucS-α1,3]-D-GlcA-β1,3}n-D-anTa14s6s-diol(n分别为2和3);这些寡糖的结构:具有以下通式:L-FucS-α1,3-D-G1cA-β1,3-{D-Ga1NAc4S6s-β1,4-[L-FucS-α1,3-]LD-G1cA}m-D-anTa1-dio1(m=0,1,2,3;FucS为L-Fuc2S4S,L-Fuc3S4S,L-Fuc4S)。因此,天然AjFG的结构可以合理地推断为具有{-4-D-GlcA-β1,3-D-GalNAc4S6S-β1-}n主链,类似于硫酸软骨素E,三种硫酸取代的支链的占比分别为Ⅰ型(Fuc2s4S～54%)、Ⅱ型(Fuc3S4S～29%)和Ⅲ型(Fuc4s～17%);HfFG结构分析:纯净HfFG的得率为0.9%;分子量为82.7 kDa;-OSO3-/-COO-摩尔比为3.756;GlcA:Ga1NAc:Fuc摩尔比约1:0.91:1.04;旋光度-50°:°,表现为左旋;1D/2D NMR谱图分析表明,dp-3含有两种三糖化合物的结构为L-FucS-α1,3-D-GlcA-β1,3-D-anTal-diol4s6s(FucS分别为 Fuc2S4S和 Fuc3S4S),两个化合物的摩尔比约为 2:1;dp-6 的化学结构为L-FucS-α1,3-D-GlcA-β1β1-D-GalNAc4S6S-β1,4-[L-FucS-α1,3-]D-GlcA-β3β1,3-D-an Tal-diol4s6S,其中FucS存在三种硫酸酯化类型,即Ⅰ型(Fuc2S4S～53%)、Ⅱ型(Fuc3S4S～28%)和 Ⅲ 型(Fuc4S～19%);dp-9 的化学结构为L-FucS-α1,3-D-G1cA-β3β1,3-{D-GalNAc4S6S-β3β1,4-[L-FucS-α1,3]-D-G1cA-β1,3}2-D-anTa14S6S-diol,其中FucS存在三种硫酸酯化类型,即Ⅰ型.(Fuc2S4S～47%)、Ⅱ型(Fuc3S4s～29%)和Ⅲ型(Fuc4S～24%);这些寡糖的结构具有以下通式:L-FucS-α1,3-DD-G1cA-β1,3-{D-Ga1NAc4S6S-β1,4-[L-FucS-α1,3-]D-GlcA}m-LD-anTal-diol(m=0,1,2;FucS为L-FuC2S4S,L-Fuc3S4S,L-Fuc4S)。因此,天然HfFG具有与AjFG相似的结构,即具有类似于硫酸软骨素E的主链和三种硫酸岩藻糖取代的侧链构成的三糖重复结构,不同之处为:HfFG的三种硫酸岩藻糖侧链占比分别为Ⅰ型(Fuc2s4s～40%)、Ⅱ型(Fuc3S4s～31%)和Ⅲ型(Fuc4s～29%);复杂FG、dAjFG其寡糖片段的抗凝血活性及副作用:与低分子量肝素(Low-molecular-weight heparin,LMWH)相比,AjFG显示出比LMWH更有效的APTT延长活性,其使APTT延长一倍所需的浓度约为LMWH的1/3,dAjFG、Fr-3和Fr-4表现出与LMWH相当或更低的APTT延长活性;然而,Fr-1和Fr-2在浓度达到128 μg/mL时也没有显示出显著活性;AjFG的抗FXase活性比LMWH高10倍以上,而dAjFG、Fr-3和Fr-4的活性略低于LMWH;然而,Fr-1和Fr-2在浓度高达1000 μg/mL仍没有显著的抗FXase活性;与阳性对照组多硫酸软骨素(over-sulfated chondroitin,OSCS)和二磷酸腺甘(adenosine diphosphate,ADP)相比,解聚产物dAjFG、Fr-1-Fr-4在实验浓度范围内无FXII激活活性,也未见明显的血小板聚集作用。结论:本研究结果清晰显示:天然AjFG中的FucS侧链均以单糖形式存在,不存在二糖或三糖形式的侧链;且全部FucS侧链均以α1,3糖苷键连接于主链G1cA,不存在连接于主链Ga1NAc的FucS。此外,主链中的GalNAc均以4,6-二硫酸酯形式存在,未见单硫酸酯化的Ga1NAc;HfFG主链与AjFG类似,硫酸取代的三种支链的占比与AjFG不同,其Fuc4s支链比例高于AjFG;活性实验表明,天然的AjFG、dAjFG、Fr-3、Fr-4和LMWH对内源性凝血有较强的抑制作用,表现出较强的APTT延长活性和对内源性FXase的抑制作用,且FG抗凝血活性随片段分子量的降低而减少,结构片段至少得包含三个或更多的三糖结构单元,才能有效的抑制FXase;副作用随片段分子量降低而减小,这提示复杂FG解聚产物、九糖及十二糖可能成为安全有效的抗凝血剂。