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食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、发病隐匿、易转移和死亡率高等特点。河南省是食管癌的高发省份,传统的治疗方法对中、晚期食管癌而言,均有一定的局限性且疗效均不能令人满意。所以,寻求食管癌生物治疗的新靶点和新途径已成为近年来的研究热点之一。真核细胞起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E）是一个分子量为24KD的蛋白,其基因定位在染色体4q21-4q25,是重要的原癌基因。eIF4E和eIF4A、eIF4G共同组成eIF4F复合体并可特异性地与真核细胞mRNA的5′末端帽结构结合,参与mRNA的翻译,在帽依赖的翻译起始阶段发挥限制调控作用。eIF4E的过度表达不仅能促进细胞的增殖反应,而且还能促进细胞的恶性转化。研究表明,eIF4E在一些人类肿瘤,如头颈部鳞癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、白血病和恶性淋巴瘤等组织中高表达,并与疾病的进展呈正相关。有学者认为,eIF4E有望成为肿瘤基因治疗的新靶点和早期诊断、评估预后的新指标。真核细胞起始因子4E结合蛋白（eIF4E binding proteins,4EBPs）是一个小蛋白家族,有4EBP1、4EBP2、4EBP3三个成员。其中4EBP1由118个氨基酸组成,编码基因定位于染色体8p12,是目前研究的比较清楚的一个,主要通过自身不同的磷酸化状态来调节eIF4E的活性。当细胞处于静止状态时,低磷酸化的4EBP1与eIF4E结合,形成eIF4E-4EBP1复合体,从而阻止了帽依赖性翻译的起始;而当4EBP1发生磷酸化后,eIF4E与4EBP1分离,从而解除对翻译的抑制作用,启动蛋白质的翻译过程。另有研究表明,使用RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞系中eIF4E表达的同时可降低4EBP1的表达量。有关在食管癌中使用RNAi技术抑制eIF4E、4EBP1表达的研究迄今尚未见文献报道。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种在动植物中广泛存在的通过双链RNA（double strand RNA,dsRNA）在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程。dsRNA进入细胞后,在dsRNA核酸酶（Dicer）作用下,被裂解成21bp-23bp的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,siRNA与一种多聚核酸酶复合物结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silence complex,RISC）,RISC同与siRNA互补的mRNA结合,发挥RNA酶作用酶切mRNA,属于转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）的一种。目前应用RNAi技术在细胞信号传导通路、抗病毒、抗肿瘤等领域的实验研究不断开展,标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。本研究应用RNAi技术特异性抑制食管癌EC9706细胞中eIF4E表达,采用免疫细胞化学、原位杂交等技术检测转染前后EC9706细胞中eIF4E、4EBP1蛋白及mRNA的表达情况,应用流式细胞技术检测转染前后细胞周期的变化情况,为临床应用RNAi技术靶向治疗食管癌提供理论依据。材料和方法1.人食管癌EC9706细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠。2.食管癌EC9706细胞的培养:食管癌EC9706细胞于RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml）,37℃、5%CO2孵箱内贴壁培养。3.siRNA的体外合成、鉴定及筛选:首先设计合成siRNA的寡核苷酸模板,5′端为T7启动子序列,在体外和T7 RNA聚合酶特异性结合转录出目的siRNA。分别合成两段特异性siRNA和一段无义对照siRNA,应用4%琼脂糖凝胶电泳,以定量模板DNA为参照,测定siRNA的长度和浓度;通过预实验筛选出一段干扰效果较好的特异性siRNA。4.转染:应用LipofusinX脂质体将siRNA转染EC9706细胞。5.应用免疫细胞化学SP法,检测转染前后各实验组、对照组中eIF4E和4EBP1蛋白的表达情况。6.应用细胞原位杂交技术,检测转染前后各实验组、对照组中eIF4E和4EBP1 mRNA的表达情况。7.应用流式细胞技术检测转染前后EC9706细胞细胞周期的变化。8.统计学处理:应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理,计量资料采用均数±标准差（（?）±S）表示;两组均数的比较用t检验（t-test）;两组以上均数的比较用方差分析（ANVOA）;以α=0.05为显著性标准。结果1.成功体外合成两条siRNA,长度均为21bp。2.EC9706细胞形态学变化:eIF4E特异性siRNA转染食管癌EC9706细胞后,可见细胞逐渐变圆,折光增强,继而开始皱缩,漂浮。3.免疫细胞化学结果:150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl三种不同浓度的特异性eIF4E siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后,eIF4E、4EBP1蛋白表达量均有所降低,其中以250ng/μl转染72h的抑制效应最为明显,各实验组与细胞对照组（不转染）、空白对照组（空脂质体）、无义对照组（转染无义siRNA）相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;每个浓度组内随转染时间增加抑制效应增强,三个时间段两两相比差异无统计学意义（P＞0.05）;每个时间段内随转染剂量增加抑制效应逐渐增强,三种浓度两两相比差异有统计学意义（P＜0.05）;空白对照组、无义对照组与细胞对照组相比均未表现出对eIF4E、4EBP1蛋白表达的抑制效应,三个对照组两两相比差异无统计学意义（P＞0.05）。4.原位杂交结果:150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl三种不同浓度的特异性eIF4E siRNA转染食管癌EC9706细胞24h、48h、72h后,eIF4E、4EBP1 mRNA表达量均有所降低,其中以250ng/μl转染72h的抑制效应最为明显,各实验组与细胞对照组、空白对照组、无义对照组相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;每个浓度组内随转染时间增加抑制效应增强,三个时间段两两相比差异无统计学意义（P＞0.05）;每个时间段内随转染剂量增加抑制效应逐渐增强,三种浓度两两相比差异有统计学意义（P＜0.05）;细胞对照组、空白对照组与无义对照组相比均未表现出对eIF4E、4EBP1 mRNA表达的抑制效应,三个对照组两两相比差异无统计学意义（P＞0.05）。5.流式细胞仪检测细胞周期:以150ng/μl、200ng/μl、250ng/μl三种不同浓度的特异性eIF4E siRNA转染食管癌EC9706细胞72h后,各时期的细胞数占细胞总数的百分比与细胞对照组、无义对照组的细胞比较具有明显的不同,G0/G1期细胞比例显著增加,S期细胞比例相对减少,差异有统计学意义（P＜0.05）;各实验组间随着转染剂量的增加,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,三种浓度两两相比差异有统计学意义（P＜0.05）;转染无义siRNA后G0/G1期及S期细胞比例与细胞对照组比较无显著差异（P＞0.05）,对食管癌EC9706细胞的细胞周期无明显影响。结论1.eIF4E siRNA可特异性抑制食管癌EC9706细胞中eIF4E蛋白及mRNA的表达。2.eIF4E siRNA在下调食管癌EC9706细胞中eIF4E蛋白和mRNA表达的同时,4EBP1蛋白及mRNA的表达亦随之下调,提示eIF4E可能通过某种特殊的机制或通路影响4EBP1的表达。3.特异eIF4E siRNA在下调食管癌EC9706细胞中eIF4E、4EBP1表达的同时,细胞生长缓慢,部分细胞死亡,细胞周期阻滞于G0/G1期,表明eIF4E siRNA可抑制食管癌EC9706细胞的增殖。