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小麦矮腥黑穗病(Wheat dwarf bunt disease, DB)是麦类黑穗病中危害最大、极难防治的国内外检疫性病害之一,是由小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn, TCK)引起的。主要分布在美洲、欧洲、北非和西亚,尤其是美国西北部7州。TCK与其近源种小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries (DC)Tul, TCT)在孢子形态、基因组水平上都具有很高的相似性,极难区分。国内外学者曾经利用rDNA的转录间区序列分析、随机扩增的多态性DNA (Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、重复片段PCR(Repetitive-element PCR, rep-PCR)基因指纹分析等方法分析腥黑穗菌的种内及种间差异,都没有成功区分开TCK和TCT。TCK与TCT的孢子形态学上非常相似,极难分辨。因此能否精确鉴定这两种腥黑穗病菌对于顺利完成检疫工作都是至关重要的。随着输华疫麦的大量流入,加之几种腥黑穗菌在形态上相互交叉,形态学检验工作量大,耗时费事,主观性强,不能满足进境原粮检疫的快速通关以及进境后疫麦中病原菌消长动态与流向监控的需求。因此建立TCK早期、快速、灵敏、准确、稳定的分子检测技术势在必行。本研究以筛选到的1322bpTCK独有差异基因设计TCK特异性引物对,建立TCK常规和定量荧光PCR技术体系,并研制出快速检测试剂盒。其研究成果将有助于对种子、土壤、原粮加工副产品、饲料和废弃物上病菌冬孢子流向和存活力进行动态监测,为制定科学的病害风险管理策略和监控方案提供技术支撑。论文主要研究结果如下:①优化了碱裂解法破冬孢子外壁-CTAB破坏原生质体,释放核酸-微量DNA过滤柱去除色素、多酚等PCR抑制物质的TCK/TCT冬孢子提取方法,排除了冬孢子细胞壁难破DNA难以提取,三甲胺、色素等PCR抑制物质导致假阴性的难题,采用此方法提取的腥黑穗菌DNA完全适用于PCR扩增。对于TCK/TCT菌丝体DNA,采用了CTAB法和氯化苄法的大量提取。对于田间样品,FTA卡法制样则实现了远程田间样品的快速制备保存与安全寄送。②建立了常规PCR检测体系。利用本实验室前期筛选的TCK独有的1322bp端粒差异片段,设计特异性引物对CQUTCK2/CQUTCK3、CQUTCK4/CQUTCK5和CQUTCK6/CQUTCK7,优化了PCR反应条件,建立了三套常规PCR检测体系,其DNA扩增靶带分别为747bp、200bp和644bp。选择重组质粒作为检测中的阳性对照,健康小麦和健康黑麦基因组DNA作为阴性对照。以腥黑穗菌属通用引物对CQUTC6/CQUTC7为内置对照,可以确定被检样品是否含PCR抑制物质进而判断检测体系是否正确,同时有效地排除样品检测结果的假阳性和假阴性。利用设计的引物对CQUTCK2/CQUTCK3、CQUTCK4/CQUTCK5和CQUTCK6/CQUTCK7进行TCK PCR检测,其特异性高,能扩增出美国全套小麦矮腥黑穗菌不同生理小种菌株的DNA片段,而对TCT的不同菌株和其他近源种DNA都不能扩增;PCR检测灵敏度可以达到0.1pg。采用建立的TCK PCR特异检测技术体系,可以快速地鉴别小麦矮腥黑穗菌冬孢子和病菌纯培养菌丝体。③首次建立了小麦矮腥黑穗菌的实时荧光定量PCR(Real time PCR, RTi-PCR)检测体系。根据差端粒差异基因片段的碱基序列,运用引物设计软件设计筛选出适用于SYBR Green I荧光染料和TaqMan杂交探针的定量PCR检测的特异性引物对CQUTCK4/CQUTCK5及探针CQUP1,优化RTi-PCR反应体系,成功地建立了两种特异、准确的小麦矮腥黑穗菌RTi-PCR检测技术。检测中用TCK的DNA重组质粒梯度稀释液建立了RTi-PCR的标准曲线。两种RTi-PCR检测体系对DNA重组质粒靶片段的检测灵敏度可达1～2 fg,对TCK基因组DNA的检测灵敏度可达5～10 fg,比常规PCR的灵敏度高出2~3个数量级。可以快速鉴别小麦矮腥黑穗菌冬孢子和检测罹病小麦植株体内病菌的侵染菌丝体,实现了田间病害的早期诊断。④对来自田间或小麦加工厂的带菌样品进行了双盲检测。运用常规PCR对人工掺加病菌冬孢子的小麦样品进行了实际检测,结果显示能准确扩增出健康小麦中每50克小麦携带的4000个TCK冬孢子。对混杂的小麦网腥黑穗菌DNA没有扩增条带;运用检测体系分别对2006～2007年间采自国内的196个黑穗菌菌瘿或罹病小麦植株样品进行实际检测,结果显示三套检测体系的检测结果是一致的,说明所建立的PCR检测体系是稳定可靠。分别采用两种PCR对小麦不同生长期的发病情况进行了动态监测,常规PCR没有靶带产生,而实时荧光定量PCR的检测最早可在三叶期或返青期早期检出罹病小麦样品的阳性信号。根据定量PCR监测结果分析,罹病植株体内病原菌的侵染菌丝体数量DNA含量极低,低于常规PCR的检测下限约100x。说明荧光定量PCR检测体系灵敏度高于常规PCR检测体系,更适合于小麦系统侵染性病害的无症样品的早期监测。⑤利用大分子稳定化技术初步研制了固相化检测试剂盒样盒。采用核酸、酶的稳定剂结合真空冷冻干燥技术成功制备出TCK的分子检测试剂盒,可常温保存和储运,即开即用、操作简便、有利于实现TCK的标准化检测。