第一部分:DACH1在胶质瘤中的表达及对胶质瘤细胞的影响【目的】研究DACH1在不同恶性程度胶质瘤中的表达情况、DACH1的表达与胶质瘤患者生存率的关系及对胶质瘤细胞活力和生存率的影响。【方法】通过对中国胶质瘤基因组图谱数据库（CGGA）中220例不同级别胶质瘤样本（97例低级别胶质瘤、34例间变性胶质瘤和89例胶质母细胞）及美国大脑肿瘤分子数据库（REMBRANDT）中410例不同级别胶质瘤样本（99例低级别胶质瘤、84例间变性胶质瘤和227例胶质母细胞）进行统计学分析,了解DACH1表达水平与胶质瘤级别之间的相关性及DACH1表达水平与胶质瘤患者生存预后的相关性。取正常培养的处于对数期的U87、U251、U87+p EGFP-DACH1、U251+p EGFP-DACH1细胞完成细胞铺板并放入培养箱中静置24h、48h、72h和96h后通过CCK8检测细胞活性并计算细胞存活率。【结果】CGGA数据库中220例胶质瘤样本和REMBRANDT数据库中410胶质瘤样本均表现为胶质瘤级别越高,DACH1表达水平越低。DACH1表达水平与胶质瘤级别呈负相关。同时分析CGGA数据库和REMBRANDT数据库发现高表达DACH1的胶质瘤患者生存期较长。在转染DACH1的胶质瘤细胞U87细胞中,在24小时后和48小时后细胞存活率与对照组相比无显著性差异（24小时后:P=0.73,48小时后:P=0.24）,但在72小时后胶质瘤细胞存活率明显下降（P=0.0001）。在转染DACH1的胶质瘤细胞U251细胞中,从24小时开始,在48小时、72小时胶质瘤细胞细胞存活率均对照组明显下降（分别为P<0.05,P<0.001）。这些结果表明DACH1的表达对胶质瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。【结论】DACH1基因在胶质瘤细胞中表现为抑癌基因的作用,其表达水平与胶质瘤细胞的恶性程度呈负相关,与胶质瘤患者的生存率呈正相关。同时DACH1基因对胶质瘤细胞具有抑制增殖的作用。提示DACH1为胶质瘤的一种抑癌基因。第二部分:DACH1对胶质瘤细胞迁移性及侵袭性影响的研究【目的】探讨DACH1对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力影响的研究。【方法】取生长对数期U87和U251细胞,分组不同处理对照组U87-CK:正常（37℃,21%O2,5%CO2）培养24h;实验组U87+p EGFP-DACH1（U87-TR）:转染后培养24h;对照组U251-CK:正常（37℃,21%O2,5%CO2）培养24h;实验组U251+p EGFP-DACH1（U251-TR）:转染后培养24h。24h后移去Transwells及相应处理后直径上取视野,照相,计数。检测、分析转染DACH1基因表达对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。【结果】细胞转染24小时后,显微镜下观察发现U87胶质瘤细胞和U251胶质瘤细胞与转染DACH1组U87胶质瘤细胞和转染DACH1组U251胶质瘤细胞形态有所改变。随后我们检测发现DACH1过表达抑制了U87胶质瘤细胞的转移和侵袭能力（P<0.01）,在U251胶质瘤细胞中DACH1的过表达也同样明显抑制了胶质瘤细胞的迁移（P<0.01）,对胶质瘤细胞侵袭性也具有抑制作用（P<0.05）。【结论】DACH1基因不仅能够对胶质瘤细胞发挥抑增殖的作用,还能够抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭,对胶质瘤的预后和进展发挥重要的作用。第三部分:DACH1调控WNT/β-catenin信号通路影响胶质瘤发生、发展的相应作用机制的研究。【目的】探讨DACH1调控WNT/β-catenin信号通路影响胶质瘤发生、发展的相应作用机制的研究。【方法】样本分为四组Normal:对照组,DACH1:过表达DACH1组（过表达DACH1基因）,Si RNA:DACH1小干扰组（转染DACH1的小干扰RNA）,DACH1+si RNA,过表达后再小干扰组（稳定过表达DACH1后,再转染DACH1的小干扰RNA）。将各组细胞处理72h后去除培养液,在每孔细胞中加入预制并冷却的1ml的磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤孔内细胞,洗涤完成后去除PBS。再次孔内加入PBS,同法操作重复洗涤细胞三次,洗涤完成后将PBS去除,将培养板放置于冰上。在每孔细胞中加入RIPA裂解液（1m M PMSF）100-200μl,充分摇匀后放置冰上,移液枪多次吹打,使裂解液均匀分布在细胞表面并和细胞充分接触。将培养板放置于摇床上,在冰上完成裂解结果30min,使得细胞充分裂解。裂解完后,用干净的刮棒快速将细胞刮于孔的一侧,然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中,用枪吹打数下直至裂解液不再黏稠,此操作在冰上进行。于4℃下将离心管置于于离心机下转速12000 rpm离心5min.（离心机提前预冷）。将离心后的上清液分装转移倒另一离心管中,并置于-80℃冰箱内保存。BCA法测定蛋白浓度。完成聚丙烯酰胺凝胶电泳,PVDF膜转膜后置于封闭液中,置摇床上缓慢摇动,室温封闭1h。将封闭完成的PVDF膜中加入一抗,在4℃环境下孵育过夜。PVDF膜浸泡于1×TBST缓冲液中,在摇床上进行轻柔洗涤10min,同法操作3次。加入二抗到完成前面操作的PVDF膜中,在室温环境下放置摇床上缓慢摇动孵育1h。PVDF膜浸泡于1×TBST缓冲液中,在摇床上进行轻柔洗涤10 min,同法操作3次。将成功完成前面系列工序的PVDF膜放置在保鲜膜上,将ECL试剂盒中等量的A液和B液适量混合,混合均匀后添加到PVDF膜表面,将其放置凝胶成像分析仪中,在化学光敏模式下进行曝光显影并记录结果。在细胞培养皿中细胞密度需大于80%,使用0.25%Trypsin和0.02%EDTA混合液进行消化,在倒置显微镜下观察细胞的消化程度,观察到细胞出现突起收缩,细胞之间的间隙变宽,细胞形态改变成接近圆形时停止消化过程,离心机保持1200rpm转速,离心持续5min,随后进行细胞传代。取纯化的细胞接种于24孔板中,（按5×104cells/ml,500μl/well标准接种）,接种完成后再培养箱中静置培养过夜。取出24孔板,分别对各组处理。之前有两组已感染了过表达DACH1的慢病毒,现取一组正常的和一组感染DACH1后的细胞同时再转染si RNA。取24孔板细胞,吸弃培养基,4%多聚甲醛室温固定20min,0.1%Triton X-100室温破膜20min,2%FBS室温封闭30min,加入适当稀释比例的一抗（1:50）,4℃环境下孵育过夜;加入适当稀释比例的荧光二抗（1:800）,4℃环境下避光孵育1h;加入10ng/ml的DAPI,4℃环境下避光孵育30min;倒置荧光显微镜下观察拍照（200×）。用蔡司共聚焦显微镜获得图像。采用Image-pro Plus 6.0软件（Media Cybemetics,Silver Spring,MD）进行图像分析。【结果】Western Blot检测明确DACH1通过慢病毒转染成功过表达。在胶质瘤细胞中DACH1过表达时胞浆内β-catenin与Cyclin D1表达出现明显下降,经过si RNA小干扰后,DACH1表达下降,而胞浆内β-catenin与Cyclin D1表达上升（P<0.05）。DACH1过表达时p-GSK-3β表达明显下降,经过si RNA小干扰后随着DACH1表达下降,p-GSK-3β表达上升（P<0.05）。DACH1能够抑制β-catenin、Cyclin D1的表达,也能使p-GSK-3β表达下降。在免疫荧光实验中过DACH1表达后β-catenin、Cyclin D1均出现下调,在DACH1被小干扰RNA敲低后,两个指标升高。【结论】DACH1基因通过WNT/β-catenin信号通路发挥调控胶质瘤细胞的机制主要表现为DACH1基因的表达使非活化型p-GSK-3β磷酸化水平下调,GSK-3β更多地发挥活性进行磷酸化β-catenin,β-catenin磷酸化后降解增多,减少了胞质中的β-catenin积累,使转移入胞核内的β-catenin也随之减少,从而减少了β-catenin对核内信号通路下游的Cyclin D1等原癌基因的激活,Cyclin D1表达水平下调从而抑制了细胞的增殖和恶性扩增,最终对胶质瘤细胞发挥抑癌基因的作用。