大量研究表明，红斑丹毒丝菌是猪丹毒的病原体，而64kDa的SpaA蛋白是该菌的主要保护性抗原，可作为研制猪丹毒亚单位疫苗的靶抗原。但是关于SpaA的免疫保护区域及其致病性尚未清楚。因此，本论文为确定SpaA免疫保护区域及其致病性开展了以下研究工作。根据猪丹毒丝菌spaA基因序列设计3对引物，用PCR从强毒株C43065基因组中分别扩增编码SpaA及其N端免疫保护区和C端重复序列的基因片段，将它们分别连接到表达载体pET-32a（+）的BamHⅠ和HindⅢ多克隆位点上，构建重组质粒pET-spaA、pET-spaA-N和pET-spaA-C，转化大肠杆菌BL21，用菌液PCR初选重组菌，通过DNA测序验证阅读框是否正确，IPTG诱导表达目的蛋白，用Ni+2亲和层析柱纯化N端带有Trx标签的重组蛋白rSpaA、rSpaA-N和rSpaA-C，用清洁兔经皮下注射抗原3次制备它们的抗体，通过小鼠免疫保护试验检测rSpaA、rSpaA-N和rSpaA-C的保护作用。SDS-PAGE和蛋白印迹结果表明，用大肠杆菌表达系统BL21/pET32a（+）成功表达了重组蛋白rSpaA、rSpaA-N和rSpaA-C，小鼠保护试验结果显示rSpaA免疫组小鼠和rSpaA-N免疫组小鼠对强毒株C43065致死性攻击的保护率均为100%，而rSpaA-C免疫组小鼠无免疫保护作用，表明SpaA的保护作用与其N端氨基酸序列有关。为了从基因水平上验证SpaA的致病性，用DNA重组技术构建中间为Tetr基因，两侧为spaA基因上下游同源序列同源的敲除载体pUC18ΔspaA，将其电转入野生株C43065，用四环素抗性和菌液PCR初选spaA基因的缺失突变株，并用组合PCR、逆转录PCR、DNA测序和蛋白印迹对突变株进行验证，结果表明spaA基因的缺失突变株C43065ΔspaA构建成功。通过细菌生长曲线测定突变株C43065ΔspaA的生长速率，采用补体试验、吞噬试验、粘附试验和小鼠毒力试验检测突变株C43065ΔspaA的致病性。显微镜观察和细菌生长曲线结果表明spaA基因的缺失突变影响了细菌的形态和生长速率；补体敏感性试验结果显示与野生株C43065和互补株C43065C相比突变株C43065ΔspaA对补体介导的杀菌作用的抵抗力显著减低，吞噬试验结果表明小鼠巨噬细胞对突变株C43065ΔspaA的吞噬指数显著高于野生株C43065和互补株C43065C；粘附实验结果显示突变株C43065ΔspaA对小鼠胚胎成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞的粘附能力显著低于野生株C43065和互补株C43065C，而小鼠毒力试验结果显示突变株C43065ΔspaA对小鼠的毒力降低了77倍，表明SpaA是猪丹毒丝菌的致病因子。