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目的:采用线栓法制备比较符合人类常见缺血性脑血管病的大鼠大脑中动脉阻塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型,研究远隔缺血后适应(Remote Ischemic Postconditioning,RIPostC)对大鼠脑缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)梗死体积及神经功能的影响,并探讨RIPostC对脑缺血再灌注损伤的作用机制。
方法:本课题分两部分进行。
第一部分:观察RIPostC对大鼠脑缺血再灌注梗死体积及神经功能的影响。采用线栓法制备大鼠缺血2h再灌注损伤模型。RIPostC的具体操作方法为:在大鼠脑缺血即刻夹闭双侧股动脉10min,放开10min,此为一个循环,共进行三个循环。神经功能评分采用Longa评分法、前肢踩空试验和12分评分法三种方法分别在脑缺血后8h、24h,3d、7d、14d、30d进行神经功能评分。然后留取脑组织标本,每组4只做石蜡块包埋,每只都以同样标准包5块蜡块,每个蜡块切片一张进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,应用计算软件分析脑梗死体积;部分大鼠应用头颅核磁共振成像扫描进一步明确了大鼠的脑缺血状况。蜡块标本同时以备下一部分的免疫荧光染色用。另外每组4只大鼠脑组织分离蛋白备下一部分实验用。分组方法:Spraguep Dawley(SD)大鼠104只,随机分为13组,每组8只:
(1)假手术组(S);
(2)8h对照组(C8h);
(3)RIPostC8h组(R8h);
(4)24h对照组(C24h);
(5)RIPostC24h组(R24h);
(6)3d对照组(C3d);
(7)RIPostC3d组(R3d);
(8)7d对照组(C7d);
(9)RIPostC7d组(R7d);
(10)14d对照组(C14d);
(11)RIPostC14d组(R14d);
(12)30d对照组(C30d)(13)RIPostC30d组(R30d)。
第二部分:研究RIPostC对大鼠脑缺血再灌注的作用机制。将上述留取的13组脑组织标本,应用免疫荧光方法及免疫印迹(Western blot)方法对脑缺血再灌注以及给予RIPostC后的样本进行髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)、少突起胶质细胞髓鞘相关糖蛋白(Oligdendrocyte associated myelin glycoprotein,OMG)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory-1α,MIP-1α)进行分析,探讨其可能的作用机制。
结果:
(1)Longa评分显示:对照组各组问比较,14d、30d的的神经功能评分明显低于8h、24h、3d(p＜0.05);RIPostC组各组间比较,7d、14d、30d神经功能评分明显低于8h、24h、3d(p＜0.05);与对照组比较,RIPostC组大鼠在7d的神经功能评分降低,但无统计学意义。前肢踩空试验结果显示:对照组各组间比较,14d、30d的的神经功能评分明显低于8h、24h、3d、7d(p＜0.05),30d的神经功能评分明显低于14d(p＜0.05);RIPostC组各组间比较,30d神经功能评分明显低于8h、24h、3d、7d、14d(p＜0.05),14d的神经功能评分明显低于8d、24d(p＜0.05),7d的神经功能评分明显低于24d(p＜0.05);与对照组比较,RIPostC组大鼠3d和7d的神经功能评分显著降低,并且有统计学意义(p＜0.05)。12分评分法结果显示:对照组各组间比较,14d、30d的的神经功能评分明显低于8h、24h、3d、7d(p＜0.05);RIPostC组各组间比较,30d神经功能评分明显低于8h、24h、3d、7d(p＜0.05),3d、14d的神经功能评分明显低于8h、24h(p＜0.05),7d的神经功能评分明显低于24d(p＜0.05);与对照组比较,RIPostC组大鼠3d和7d的神经功能评分显著降低,并且有统计学意义(p＜0.05)。
(2)脑梗死体积分析显示:RIPostC组与对照组相比,RIPostC组大鼠在脑缺血再灌注损伤后8h、24h、3d、7d的脑梗死体积均明显降低,具有统计学意义(p＜0.05)。
(3)Westernblot结果:皮层区各时间点的MAG含量,与假手术组比较,对照组和RIPostC组大鼠脑缺血再灌注后各时间点MAG的表达均有增加,但无统计学意义;对照组和RIPostC组比较,无明显差异。基底节区各时间点的MAG含量,与假手术组比较,对照组和RIPostC组大鼠脑缺血再灌注后MAG的表达均有增加,其中对照组24hMAG表达明显增加,并有统计学意义(p＜0.05),但在30d时表达减少,尚无统计学意义;与对照组比较,RIPostC组大鼠脑缺血再灌注后MAG的表达有减少,尚无统计学意义。皮层区各时间点的OMG含量,与假手术组比较,对照组和RIPostC组大鼠脑缺血后OMG的表达均有减少,尚无统计学意义;与对照组比较,RIPostC组大鼠脑缺血再灌注后OMG的表达有增加,尚无统计学意义。基底节区各时间点的OMG含量,与假手术组比较,对照组和RIPostC组大鼠脑缺血后OMG的表达均有减少趋势,其中对照组30dOMG表达显著减少,并有统计学意义(p＜0.05);对照组和RIPostC组两组比较无明显差异。皮层区MIP-1α含量,与假手术组比较,对照组和RIPostC组大鼠脑缺血后MIP-1α的表达均有增加,尚无统计学意义;对照组各组间比较14d、30d的表达明显低于24h(p＜0.05);与对照组比较,RIPostC组大鼠脑缺血后24hMIP-1α的表达显著减少(p＜0.05),其他各时间点的差异未见统计学意义。基底节区MIP-1α含量,与假手术组比较,对照组和RIPostC组大鼠脑缺血再灌注后各时间点MIP-1α的表达均有增加,尚无统计学意义;与对照组比较,RIPostC组大鼠脑缺血再灌注后MIP-1α的表达有减少,无统计学意义。
(4)免疫荧光显示:MAG、OMG、MIP-1α主要在细胞间质中表达。
结论:本研究应用大鼠大脑MCAO模型,证明远隔夹闭/放开双侧股动脉,夹闭10min,放开10min,如此3次循环的RIPostC可以减少大鼠脑缺血后8h、24h、3d和7d的脑梗死体积,改善脑缺血后3d和7d的神经功能评分,具有神经保护作用。其作用机制可能有MIP1-α的参与,MAG和OMG也有可能参与了此保护机制,但需要进一步研究。