1.水解单宁对暗纹东方鲀摄食偏好、消化代谢和抗氧化能力的效应研究为了解菜粕替代鱼粉时单宁发挥的作用,配制四组等氮等能饲料饲喂初重(39.84±3.09)g的暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)56天。以含43%鱼粉的实用基础饲料OT0为对照;另设置三个不同的鱼粉用量组,用酪蛋白平衡蛋白质含量,并添加0.25%(OT1),0.75%(OT2)和1.25%(OT3)的水解单宁,使酪蛋白:水解单宁≈菜粕中蛋白含量:菜粕中单宁含量=16.8:1。结果显示,随饲料单宁含量增加,增重率提高(P>0.05),饲料系数显著下降(P<0.05)。肌肉粗脂肪含量OT2组显著高于OT0及OT1组(P<0.05),对照组中肌肉氨基酸水平显著高于其他组(P<0.05)。肝脏抗氧化指标中,OT3组丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于其他组(P<0.05),总抗氧化能力(T-AOC)对照组显著高于其他组(P<0.05)。血清抗氧化指标中,三个单宁组MDA含量均显著高于对照组,过氧化氢酶(CAT)活力显著下降(P<0.05);血清谷丙转氨酶(GPT)活性先升后降,与肝脏趋势一致,OT2与OT3组血清总蛋白(TP)含量均显著低于其他组(P<0.05)。肠道淀粉酶活性先升后降,胃和肠道中的蛋白酶活显著上升(P<0.05),胃脂肪酶活性显著下降(P<0.05)。OT3组苦味受体T2R1表达量在舌尖和肠道均显著高于对照组(P<0.01);肝脏热休克蛋白HSP70表达量OT0组显著高于OT3(P<0.05);驯化前暗纹东方鲀摄食偏好随单宁含量增加显著下降(P<0.05),驯化8周后,四组实验鱼对OT2饲料的偏好程度均显著高于OT0,OT0饲料高于OT1,OT3组最低(P<0.05)。结果表明,在该实验水平下,1.25%及以下水解单宁对暗纹东方鲀生长无负面影响,一定程度上对饲料有节约作用;单宁含量在1.25%时会损伤蛋白质消化及代谢能力,损伤肝脏健康及抗氧化能力;用含有单宁的饲料驯化暗纹东方鲀可显著提高其对单宁含量为0.75%的饲料的偏好程度并提高对苦味的接受能力。2.饲料中菜粕对暗纹东方鲀抗氧化及肠道健康的影响为了评价饲料中菜粕(RM)对暗纹东方鲀的影响,配制四组等氮等能饲料,分别含有0、10%、20%及30%的菜粕(OR0、OR10、OR20、0R30,单宁含量与实验1相当),饲喂初重37.93±2.41的暗纹东方鲀56天。结果表明,OR0和OR10的增重率明显高于OR30(P<0.05),饲料系数则呈相反趋势。肝脏中,OR20和OR30的MDA含量和CAT活性显著高于OR0,OR10最低(P<0.05),OR0和OR10的SOD活性显著低于其他组(P<0.05),T-AOC和谷胱甘肽(GSH)含量随菜粕水平升高,谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性则显著降低(P<0.05)。血清中CAT、SOD活性及ALB含量随菜粕水平升高而下降(P<0.05),MDA含量和GPT活性升高(P<0.05),OR0及OR10组总蛋白(TP)含量显著高于其他组(P<0.05),OR20和OR30组谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT)活性显著高于其他组(P<0.05)。肠道中,MDA含量随菜粕水平升高而增加(P<0.05),SOD活性先升高,后于OR20组下降(P<0.05)。OR0组和OR10组CAT活性显著高于其他各组(P<0.05)。后肠OR0组肠皱褶高度高于OR10和OR30组(P<0.05),OR30组组织形态明显受损。肠道中TGFβ1的相对表达水平随菜粕增加显著上调(P<0.05),OR30组IL-1表达量显著高于OR0组(P<0.05),OR20组IL-8表达水平显著高于OR10,OR0及OR30最低(P<0.05),肝脏HSP70则显著下调(P<0.05),OR30组TNFα在肠道中的相对表达高于其他组(P<0.05)。因此,在该实验水平下,20%及以上的菜粕可诱导河豚的氧化应激,破坏后肠结构,引起肠道炎症。3.饲料中菜粕对暗纹东方鲀营养代谢的影响及代谢组学初步研究为探究菜粕对暗纹东方鲀营养代谢的影响,就第二章中的实验鱼进行进一步检测。结果表明,暗纹东方鲀肌肉脂质含量随RM水平的增加而显著降低(P<0.05),灰分则呈相反趋势(P<0.05),OR30组蛋白含量显著低于其他组(P<0.05)。OR30组肌肉必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸的百分比明显低于其他组(P<0.05)。OR0组肌肉饱和脂肪酸(SFA)比例显著高于其他组(P<0.05)。肝脏中,GPT活性随RM水平增高而下降(P<0.05),OR0组的GOT活性显著高于其他各组(P<0.05),MDA含量先下降后上升(P<0.05)。血清中OR0及OR10组的总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量均显著高于OR20及OR30组(P<0.05)。OR30的尿素氮含量显著高于OR0(P<0.05),OR10和OR20最低。血清中甘油三酸酯(TG)和总胆固醇(TC)含量随RM显著升高(P<0.05)。OR30组的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量明显高于OR20(P<0.05),OR20组高于OR0,OR10组最低。肠道淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶活性显著下降(P<0.05)。胃中OR20的淀粉酶活性显著高于OR10和OR30(P<0.05),OR0最低,脂肪酶活性下降(P<0.05),蛋白酶活性呈相反趋势(P<0.05)。肝脏中,OR20中脂肪酸合成酶(FAS)的相对表达量明显高于OR0(P<0.05),OR30及OR10最低。OR10中脂蛋白脂酶(LPL)的相对表达低于OR0(P>0.05),OR30显著高于OR20(P<0.05),OR20高于OR10(P<0.05)。肉碱转移酶(CTP1β)的相对表达量OR10显著高于OR30(P<0.05),OR0和OR20最低。肠道中,GDH1的相对表达量显著上调(P<0.05)。在代谢组学分析结果表明,河豚肝脏中,OR0和OR10组间共鉴定出29个差异代谢物,与OR0组相比,OR10中有22个代谢物下调,7个代谢物上调。OR0与OR30组间有57个SDMs,与OR0组相比,OR30中有41个代谢产物下调,16个代谢产物上调。OR10与OR30组间有31个SDMs,与OR10组相比,OR30中有26个代谢产物下调,5个代谢产物上调。这些差异代谢物中,部分标志性代谢物与蛋白质及脂质代谢相关。说明在该实验水平下,20%及以上含量的菜粕抑制了蛋白质的吸收和生物合成,对脂质吸收也产生了不利影响,营养物质代谢的改变可能与这几条代谢通路有关:柠檬酸循环、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、酪氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢,丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢。4.饲料中水解单宁及菜粕对草鱼抗氧化能力及肠道、肝胰脏健康的影响为了评价饲料中菜粕对草鱼抗氧化能力和机体健康的影响,及该过程中单宁发挥的作用,配制八组等氮等能饲料,其中四组为半纯化饲料,以酪蛋白及明胶为主要蛋白源,添加0%(GT0),0.75%(GT1),1.25%(GT2)和1.75%(GT3)的水解单宁;另外四组为实用饲料,分别含有0(GR0)、30(GR30)、50(GR50)及70(GR70)的菜粕,且单宁的含量与半纯化饲料组相当。使用八组饲料饲喂草鱼56天后。半纯化组中,各组草鱼之间的存活率和增重率无显著差异(P>0.05),GT2组草鱼的摄食率及饲料系数显著高于GT0组(P<0.05)。肝胰脏中,随菜粕含量增加,MDA含量明显升高,后于GT3组下降(P<0.05),GT0和GT1组SOD活性显著低于其他组(P<0.05),GT3组CAT活性显著高于GT0组(P<0.05),GT1组T-AOC高于GT0,GT0组高于GT2和GT3组(P<0.05)。血清中SOD活性先升高后于GT3组降低(P<0.05),GOT活性与SOD趋势相反(P<0.05),GT2的GPT活性明显高于GT1(P<0.05),GT0组总抗氧化能力显著高于GT1及GT3,GT2最低(P<0.05)。头肾溶菌酶活性、肠内MDA含量及SOD活性随单宁含量增加显著升高(P<0.05),而肠道及肝胰脏中GPx活性、GSH含量与单宁呈负相关(P<0.05)。添加单宁组后肠皱褶高度明显降低,组织形态学受损。GT0组肠道中IL-8m RNA和Nrf2m RNA的相对表达明显低于其他各组(P<0.05),IL-10m RNA的表达随单宁含量增加而上调(P<0.05)。Keap1在GT2组中的相对表达明显高于GT1,GT0最低(P<0.05)。实用组中,存活率和增重率无显著变化(P>0.05),GR70组草鱼的饲料系数显著高于其他组(P<0.05)。肝胰脏中,GR50组MDA显著高于其他组(P<0.05)。GR70组SOD活性显著高于其他组(P<0.05),GR50组CAT活性显著高于GR70,GR0及GR30最低(P<0.05)。总抗氧化能力GR50组显著高于GR30,GR0及GR70最低(P<0.05)。GSH含量随RM水平显著降低(P<0.05),GR30组GPx活性显著高于GR0,GR0组高于GR50组,GR70组最低(P<0.05)。血清中SOD活性随菜粕含量增加而升高(P<0.05),T-AOC显著降低(P<0.05),GR70组GPT活性显著低于其他组(P<0.05),GR70组GOT活性显著高于GR30组,GR0组最低。在肠道中,草鱼MDA含量和SOD活性随菜粕含量增加显著升高(P>0.05),GPx活性和GSH含量则明显降低(P<0.05)。在头肾中,GR50和GR70溶菌酶活性明显高于GR0和GR30(P<0.05),ACP活性下降(P<0.05)。GR50及GR70组后肠组织形态受损。GR70组IL-8m RNA在肠道的表达量显著高于其他组,IL-10m RNA表达量随饲料中菜粕含量增加显著上调(P<0.05),GR0组Nrf2RNA的表达量显著高于GR30及GR50(P<0.05)。Keap1在GR30组中的相对表达明显高于GR50,GR50高于GR70,GR0最低(P<0.05)。本研究发现在该实验条件下,50%的菜粕和0.75%的水解单宁可诱导草鱼产生氧化应激,损伤抗氧化能力,破坏后肠结构,引起肠道炎症。5.水解单宁对草鱼营养代谢的影响为探究饲料中可水解单宁对草鱼营养代谢的影响,对第四章中用含有0、0.75、1.25、1.75%单宁的半纯化饲料(GT0、GT1、GT2、GT3)饲喂56d的草鱼检测营养指标及各项生理生化指标。结果表明,GT0和GT3组的肌肉蛋白含量显著高于GT2,GT1组最低(P<0.05),而GT0组的脂质含量显著高于其他各组(P<0.05)。GT0组肌糖原及肝糖原含量显著低于其他组(P<0.05)。GT3组肌肉饱和脂肪酸的比例显著高于GT0,GT1及GT2组最低(P<0.05),GT3组单不饱和脂肪酸比例显著高于其他组(P<0.05),GT1和GT2组多不饱和脂肪酸比例显著高于GT0,GT3最低(P<0.05)。随着饲料中单宁水平的升高,肠道中蛋白酶和淀粉酶活性显著升高(P<0.05),GT0和GT1组的脂肪酶活性显著高于GT2和GT3组(P<0.05)。肝脏GPT活性随单宁水平升高而降低(P<0.05),GT2与GT3组GOT活性显著低于其他组(P<0.05)。GT2血清TP明显高于GT0和GT1,GT3最低(P<0.05),GT2球蛋白明显高于GT0和GT3,GT1最低(P<0.05),而GT1的白蛋白显著高于其他组(P<0.05)。GT0组尿素氮显著高于其他各组(P<0.05),甘油三酯、总胆固醇含量随单宁水平显著升高,于GT3组降低(P<0.05),LDL-C含量先升后降(P<0.05),HDL-C显著降低(P<0.05)。随着饲料中单宁含量的增加,肠道TOR m RNA表达显著上调(P<0.05)。在肝脏中,葡萄糖激酶在GT1中的表达明显高于GT2,GT2高于GT0,GT3中的表达最低(P<0.05),而丙酮酸激酶在GT2中的表达明显高于GT0和GT1,在GT3中最低(P<0.05)。GT3中脂蛋白脂肪酶表达随单宁水平升高而上调,于GT3组下调(P<0.05),脂肪酸合成酶表达随单宁含量增加而下调(P<0.05)。综上所述,在不影响生长的情况下,该实验水平的草鱼能耐受1.75%的单宁。然而,1.25%的水解单宁影响了蛋白质的消化和代谢,减少脂质沉积,促进了糖类的利用。6.饲料中菜粕对草鱼营养代谢的影响为探究饲料中可菜粕对草鱼营养代谢的影响,对第四章中用含有0、30、50、70%菜粕的饲料(GR0、GR30、GR50、GR70)饲喂56d的草鱼检测营养指标及各项生理生化指标。结果表明,草鱼肌肉灰分及肌糖原含量随菜粕水平增加而增加(P<0.05),蛋白及脂肪水平则显著降低(P<0.05)。肌肉必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸的比例在各组间无显著差异(P>0.05)。GR50组饱和脂肪酸比例低于GR70和RG30组,GR0组最高(P>0.05),GR0组单不饱和脂肪酸比例显著低于其他组(P<0.05),GR50组多不饱和脂肪酸比例高于GR0组,GR0组高于GR30和GR70(P>0.05)。草鱼肠道蛋白酶活性随菜粕水平显著升高(P<0.05),GR50组淀粉酶活性显著高于GR70,GR0及GR30最低(P<0.05),而脂肪酶活性显著降低(P<0.05)。肝胰脏中,GOT活性随单宁含量降低,GPT活性显著降低,于GR70组上升(P<0.05),GR0组的肝糖原含量显著低于其他组(P<0.05)。血清中,GR50组总蛋白含量显著高于其他组(P<0.05),GR50及GR70组白蛋白含量显著低于GR0及GR30组(P<0.05),球蛋白水平则相反(P<0.05)。尿素氮含量随菜粕水平显著降低(P<0.05)。甘油三酯含量随菜粕水平的增加而降低,于GR70组升高(P<0.05),GR30组总胆固醇含量显著高于GR0及GR50,GR70组最低(P<0.05)。GR30的LDL-C含量显著高于GR50,GR0及GR70最低(P<0.05),GR70组HDL-C含量显著低于其他组(P<0.05)。肠道中GR0组TOR m RNA表达量显著高于GR70,GR30及GR50最低(P<0.05)。肝胰脏中,GR50组葡萄糖激酶表达量显著高于GR0及GR30组,GR70最低(P<0.05),GR30组丙酮酸激酶表达量显著高于其他组(P<0.05)。脂蛋白脂酶相对表达随着菜粕含量的增加显著上调,于GR70组降低(P<0.05)。GR50及GR0组脂肪酸合成酶表达量显著高于GR30及GR70(P<0.05)。综上所述,30%的菜粕水平对草鱼糖类利用可能有一定的促进作用。但30%以上的菜粕会影响该规格草鱼对蛋白质的消化和代谢,而50%以下的菜粕对脂肪的利用及减少脂肪沉积有着一定的促进作用。7.饲料中单宁及菜粕对草鱼肠道菌群和营养代谢的影响及代谢组学初步研究为探究菜粕对草鱼营养代谢的影响及单宁在此过程中发挥的作用,使用四组饲料饲喂草鱼56天。其中两组为实用饲料:GR0饲料含有10%鱼粉,GR50饲料含50%菜粕而无鱼粉;另外两组为半纯化饲料,分别添加了0(GT0)和1.25%(GT2)的水解单宁。GR50饲料中的单宁含量与GT2接近。结果表明,GR50组草鱼的增重率显著低于GR0(P<0.05),而GT2组的饲料系数显著高于GT0(P<0.05)。与相应处理组相比,GR50和GT2的肌肉脂质和蛋白质含量明显低于GR0及GT0组(P<0.05),而肌糖原含量则相反(P<0.05)。GT2组肌肉PUFAs比例明显高于GT0组(P<0.05),GR50组SFAs比例显著低于GR0组(P<0.05)。肠道中,GR50及GT2组蛋白酶及淀粉酶活性显著高于相应的对照组(P<0.05),而脂肪酶活性则相反(P<0.05)。与相应对照组相比,GT2和GR50组肝胰脏中的GOT和GPT的活性显著低于相应对照组(P<0.05),而肝糖原和丙二醛含量则相反(P<0.05)。血清中,总蛋白、球蛋白和甘油三酯含量在GT2和GR50组均显著高于GT0及GR0组(P<0.05)。代谢组学分析结果表明,肝胰脏中,GT0和GT2组间共鉴定出29个差异代谢物,与GT0相比,GT2组中有23个代谢物下调,6个代谢物上调。GR0与GR50组间鉴定出92个差异代谢物,与GR0相比,GR50中有31个代谢物下调,61个代谢物上调。单宁添加组和菜粕添加组的肠道菌群多样性均高于相应对照组,说明肠道环境受到干扰,部分产生消化酶的细菌的丰度增加,可能参与营养物质的消化。综上所述,1.25%的单宁含量不是GR50组草鱼生长不良的主要原因,菜粕可能改善了饲料中油脂的利用,但抑制了蛋白质的代谢;菜粕中的单宁可能是引起蛋白质和脂质代谢异常的部分原因,水解单宁对糖代谢有一定的促进,但菜粕中所含的单宁似乎比外源性水解单宁添加物具有更复杂的作用。这些营养物质代谢的改变可能与下列代谢通路有关:β-丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、不饱和脂肪酸合成、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢此外,单宁和菜粕可调节肠道菌群,可能通过发酵饲料中的营养、产生消化酶、调节益生菌等来调节肠道功能。