乳蛋白合成的机理是重要的生命科学基础问题之一,近年来的研究已有一些明显的进展。目前,己发现催乳素通过JAK/STAT5信号通路在转录水平调控乳蛋白合成,氨基酸通过mTOR/S6K1信号通路在翻译水平调控乳蛋白合成。但乳腺细胞内乳蛋白合成还有哪些重要的信号分子参与转录和翻译调控,什么分子是氨基酸等营养素的“分子传感器”,细胞核和细胞液之间的串话如何应答氨基酸信号从而调节乳蛋白的合成等,仍是现今泌乳生物学领域尚待解决的重要科学问题。本实验较系统全面的研究了甘氨酰tRNA合成酶作为一个新的信号分子,接受蛋氨酸信号,从转录水平和翻译水平对奶牛乳腺上皮细胞中p-酪蛋白(CSN2)合成的调节作用及其机理。实验既为人们弄清楚氨基酸对乳蛋白的调节及其作用机理提供基本理论依据,也为人们全面了解乳蛋白合成的网络信号通路提供了一个新的视野。本研究采用组织块培养法,培养并纯化体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,用蛋白质免疫印记(WB)和免疫荧光(IF)检测细胞中角蛋白18(CK18)和CSN2的表达以鉴定细胞的纯度和泌乳功能。实验通过在培养液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸,建立了细胞的泌乳模型,用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、WB和IF等方法,检测添加蛋氨酸泌乳模型中,GlyRS的表达与定位情况。结果表明,在蛋氨酸促进细胞泌乳时,GlyRS的表达显著上升(p<0.01),并且GlyRS的入核也显著增加(p<0.01)。这说明,在蛋氨酸上调CSN2表达的过程中,GlyRS可能是一个重要的调节因子。对GlyRS进行过表达与干扰,利用qRT-PCR、WB和IF等方法检测mTOR、p-mTOR、 Stat5a、p-Stat5a、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1和CSN2的表达,用CASY细胞活力分析仪和流式细胞仪分析测定细胞活力、细胞数和细胞的增殖率。结果显示,GlyRS过表达和干扰后,乳蛋白合成相关蛋白的磷酸化和CSN2均分别显著上升和下降(p<0.01),细胞活力、细胞数和细胞的增殖率也分别显著增加和减少(p<0.01),而乳蛋白合成相关蛋白的非磷酸化形式无显著变化(p>0.05)；添加蛋氨酸后,检测的各蛋白的表达均显著上升(p<0.01),但GlyRS干扰组,添加蛋氨酸不能使相关磷酸化蛋白和CSN2的表达恢复。这说明,GlyRS能接受蛋氨酸的信号,上调CSN2合成相关信号分子的磷酸化、促进CSN2的合成及细胞增殖,且蛋氨酸上调CSN2合成和促进细胞增殖的信号很大一部分是由GlyRS接受并传递的。构建His-GlyRS载体与GlyRS-His载体,提胞浆胞核蛋白,WB检测GlyRS的入核及分子剪切。结果显示,GlyRS在细胞中存在3种分子形式,在胞浆中为80-100kDa的全长形式,在胞核中在近N端剪切,剪切为为10-15kDa和60-80kDa的两个分子形式。这说明,在GlyRS的入核过程中存在分子剪切,且剪切位点在N端。运用生物信息学手段分析GlyRS序列中可能的NLS序列,结果显示,在GlyRS氨基酸序列中,有RKLK (79-82)和KARKR (99-103)序列,基本符合NLS的经典通式K-(K/R)-X-(K/R)和R/K-X(10-12)-R-R-K-K,可能为GlyRS的NLS。用氨基酸点突变技术,将预测的NLS中的碱性氨基酸(R和K)分别突变成丙氨酸(A),IF检测氨基酸点突变后GlyRS的定位变化,结果表明RKLK(79-82)和KARKR(99-103)序列中任意一个碱性氨基酸(R和K)的突变均导致GlyRS不能入核。综合上述结果说明,GlyRS在细胞中存在分子剪切,GlyRS在细胞浆中为全长蛋白,在胞核中,在近N端断开,剪切成10-15kda和60-80kda两个片段。GlyRS序列中79-82、99-103这两段序列是NLS。用免疫共沉淀(Co-IP)、液质联用质谱鉴定(L/MS)和激光能量共振转移(FRET)等技术,鉴定胞浆中GlyRS的互作蛋白有113个,在胞核中GlyRS的互作蛋白有41个,并且在胞核中,GlyRS在544位苏氨酸(T544)和704位丝氨酸(S704)处有磷酸化。胞浆互作蛋白中,实验选择真核翻译延长因子1A1 (eEFlA1)和真核翻译起始因子2D (eIF2D)作为目标蛋白继续研究：胞核互作蛋白中,选择核转录因子NFκB1作为目标蛋白继续研究。应用定量免疫共沉淀和激光共聚焦共定位等技术,检测添加蛋氨酸对GlyRS与eEFlA1、eIF2D和NFκB1互作的影响。结果显示,添加蛋氨酸泌乳模型中,GlyRS与eEFlA1的结合显著减少(p<0.01),与eIF2D, NFκB1的结合显著增加(p<0.01)。对GlyRS进行过表达和干扰,WB检测相关蛋白表达的变化。结果显示,GlyRS过表达后,eIF2D, NFκB1和CSN2的表达显著增加(p<0.01),eEFlA1的表达无显著变化(p>0.05)；GlyRS干扰后,eIF2D, NFκB1和CSN2的表达显著下降(p<0.01),eEFlA1的表达无显著变化(p>0.05)。这说明,eIF2D和NFκB1可能参与GlyRS对CSN2合成的调节,而eEF1A1可能不参与此调节过程。对NFκB1进行过表达,WB检测相关蛋白表达的变化。结果显示,NFκB1过表达后,CSN2的表达显著增加(p<0.01)。这说明,NFκB1对细胞中的CSN2的合成有正向调节作用。综合上述结果说明,GlyRS在胞浆中与eIF2D结合,从翻译水平上调CSN2的表达,在胞核中与NFκB1结合,从转录水平上调CSN2的表达。根据质谱的磷酸化位点鉴定结果,突变GlyRS的磷酸化位点,IF检测氨基酸点突变后GlyRS的定位变化,结果表明,T544和S704任意一个位点突变成丙氨酸后,GlyRS均不能入核,这说明,GlyRS入核的机制可能如下：GlyRS接受蛋氨酸信号,T544和S704发生磷酸化,磷酸化的GlyRS由核引导序列引导入核。应用染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法,检测GlyRS、NFκB1与CSN2启动子的结合。结果显示,GlyRS不与CSN2的启动子结合,而NFκB1与CSN2的启动子结合,其结合区域在CSN2转录起始位点上游的-1065～-1543区间内。这说明,在蛋氨酸调节泌乳过程中, GlyRS入核后并不直接与CSN2启动子结合,而是通过与NFκB1的互作,促进NFκB1与CSN2启动子的结合来上调CSN2的表达。综上所述,GlyRS作为一个重要信号分子,能接受氨基酸(如蛋氨酸)信号,正向调节CSN2合成,其可能的调控机制如下：GlyRS接受氨基酸(如蛋氨酸)后,一部分在胞浆中与eIF2D结合,在翻译水平上上调CSN2的表达,一部分在544位苏氨酸和704位丝氨酸发生磷酸化,然后由NLS引导入核,并发生分子剪切,剪切后的C端与NFκB1结合,促进NFκB1与CSN2启动子结合,从转录水平上上调CSN2的表达。