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硫酸多糖是一类糖羟基上带有硫酸基的多糖,包括从植物中提取的各种硫酸多糖、肝素、天然中性多糖的硫酸衍生物及人工合成的各种硫酸化多糖。研究表明,硫酸多糖比天然多糖具有更强的或新的生物活性。为了获得更多的硫酸多糖,可对天然多糖进行硫酸化修饰。枸杞多糖(LBPS)和当归多糖(CAPS)分别是中药枸杞和当归的主要有效成分,本研究以这两种多糖为材料,进行硫酸化修饰,通过体内外试验测定了两种硫酸化多糖的抗病毒和增强免疫活性,并与本试验室前期筛选出的硫酸化黄芪多糖(sAPS)、硫酸化淫羊藿多糖(sEPS)和硫酸化香菇多糖(sLNT)进行比较。本研究的目的,旨在验证硫酸化修饰提高枸杞多糖和当归多糖的生物活性的可能性,探讨硫酸化多糖生物活性与硫酸基取代度的关系,筛选出抗病毒和增强免疫活性最好的硫酸化多糖,为研制多糖类抗病毒制剂和免疫增强剂提供材料。试验分为以下七个部分：试验I硫酸化枸杞多糖和硫酸化当归多糖的制备用水煎醇沉法提取枸杞粗多糖,用Sevage法去蛋白,过Sephadex G-75柱层析,冷冻干燥,得到纯化的枸杞多糖。纯化的当归多糖由本研究室提供。按照本研究室用响应面法建立的硫酸化多糖取代度与反应温度、反应时间和氯磺酸-吡啶比例函数关系的回归模型,每种多糖分别设定4个修饰条件,进行硫酸化修饰,分别得到4个硫酸化枸杞多糖sLBPSs (sLBPS0.7、 sLBPS1.1、sLBPS1.5、sLBPS1.9)和4个硫酸化当归多糖sCAPSs(sCAPSo.6、sCAPS1.1、 sCAPS1.9、sCAPS2.2),作为以下试验研究的材料。试验Ⅱ 两种硫酸化多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响 用MTT法测定4个sLBPSs.4个sCAPSs以及未修饰的LBPS和CAPS对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,取安全浓度范围内的各多糖与新城疫病毒(NDV)以3种方式(先加多糖后加病毒,先加病毒后加多糖,多糖和病毒感作后加)加入到培养的CEF中,比较NDV感染细胞能力(细胞A570值和病毒抑制率)的变化。结果显示,先加多糖后加病毒时,除sLBPS0.7、LBPS和sCAPS0.6组外各多糖组各有1～5个浓度组的A570值显著大于病毒对照组,sLBPS1.1、sLBPS1.5、 sLBPS1.9、sCAPS2.2和sCAPS1.1组的病毒抑制率高于相应未修饰多糖组；先加病毒后加多糖时,除LBPS和sLBPS0.7组外各多糖组各有1～5个浓度组的A570值显著大于病毒对照组,除sLBPS0.7外各sLBPSs组的病毒抑制率均显著高于LBPS组,各sCAPSs组的病毒抑制率多高于CAPS组;多糖和病毒感作后加时,各硫酸化多糖和CAPS组各有1～5个浓度组的A570值显著大于病毒对照组,sLBPS1.5和sLBPS1.1组的病毒抑制率显著高于LBPS组,sCAPS2.2和sCAPS1.9组的病毒抑制率高于CAPS组。以上结果表明,8个硫酸化多糖和CAPS在适当的加药方式和浓度显著抑制NDV感染CEF,硫酸化修饰能够提高枸杞多糖和当归多糖的抗病毒活性,并与硫酸基取代度有一定的相关性。综合评价以sLBPS1.5和sCAPS2.2的作用较强。试验Ⅲ 两种硫酸化多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响将4个sLBPSs、4个sCAPSs以及未修饰的CAPS、LBPS分别稀释成5个浓度,单独或与PHA同时加入到培养的鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖(细胞A570值和细胞增殖率)的变化。结果显示,单独加入时,sLBPS1.9、sLBPS1.5和sLBPS1.1所有浓度组的A570值显著大于细胞对照组,sCAPS1.1、sCAPS1.9、sCAPS2.2分别有1～4个浓度的A570值显著大于细胞对照组,sLBPS1.9、sLBPS1.5和sLBPS1.1组的淋巴细胞增殖率显著高于LBPS组,sCAPS2.2和sCAPS1.9组的淋巴细胞增殖率显著高于CAPS组；与PHA同时加入时,除sCAPS0.6外各多糖组各有1～5个浓度组的A570值显著大于PHA对照组,sCAPS2.2和sCAPS1.9组的淋巴细胞增殖率显著高于CAPS组。以上结果表明,硫酸化枸杞多糖和硫酸化当归多糖在合适的取代度和剂量能单独或协同PHA刺激淋巴细胞增殖,硫酸化修饰能够提高枸杞多糖和当归多糖的增强免疫活性,并与硫酸基取代度有一定的相关性。综合评价,sCAPS2.2、 sCAPS1.9、sLBPS1.9、sLBPS1.5的作用较强。试验Ⅳ 两种硫酸化多糖对鸡新城疫的疗效的比较 体外抗病毒试验筛选出效果较好的sCAPS2.2和sLBPS1.5,本试验进一步比较了2种硫酸化多糖高、中、低3种剂量的体内抗新城疫病毒活性,以本实验室前期筛选的硫酸化黄芪多糖(sAPS)、硫酸化淫羊藿多糖(sEPS)和硫酸化香菇多糖(sLNT)为对照。21日龄雏鸡550羽随机均分为11组,除空白对照组外均用新城疫病毒攻毒,隔天出现明显症状后6个硫酸化多糖组每羽分别给予4、2、1 mg的sCAPS2.2和sLBPS1.5、3个多糖对照组每羽分别给予1 mg的sAPS、sEPS和sLNT,每天1次,连续3 d,每天观察各组的临床症状和死亡情况,攻毒后第14 d统计各组的死亡率、痊愈率和保护率；分别于攻毒前1天和攻毒后第3、7、14d翼静脉采血测定血清抗体效价。结果显示,除了sLBPS1.5中、低剂量组外,其余各多糖组的死亡率均显著低于、保护率显著高于病毒对照组,sAPS组的死亡率最低、保护率最高,sCAPS22中剂量组的痊愈率最高,各多糖组的抗体效价多显著高于病毒对照组。以上结果表明,几种修饰多糖对鸡新城疫有一定的治疗作用,并能促进抗体生成,sAPS、sCAPS2.2中剂量和sEPS的作用较强。试验V两种硫酸化多糖对鸡新城疫苗免疫应答的影响体外增强免疫试验筛选出效果较好的sCAPS2.2vsCAPS1.9、LBPS1.9、sLBPS1.5、本试验进一步比较了这4个硫酸化多糖的体内增强免疫活性。14日龄雏鸡180只随机均分为9组,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ系苗免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,4个硫酸化多糖组分别肌肉注射4个硫酸化多糖2.0 mg,3个多糖对照组分别肌肉注射CAPS、LBPS和粗当归多糖2.0 mg,免疫对照组和空白对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3 d。分别于首免后第7、14、21和28 d检测血清HI抗体效价和外周血淋巴细胞增殖。结果显示,sCAPS2.2和sLBPS1.5组在各时间点、sCAPS1.9和sLBPS1.9组在后3个时间点的抗体效价显著高于免疫对照组；sCAPS1.9、sLBPS1.9和sLBPS1.5组在后3个时间点、sCAPS2.2在首免后7和21 d的淋巴细胞A570值均显著大于免疫对照组,sLBPS1.9、 sLBPS1.5和sCAPS2.2组的淋巴细胞增殖率显著高于免疫对照组。以上结果表明,4个修饰多糖均能显著增强新城疫苗的免疫应答,作用强于未修饰多糖,综合评价sCAPS2.2和sLBPS1.5的作用较强。试验Ⅵ 两种硫酸化多糖对新城疫苗免疫雏鸡IFN-γ和IL-10的分泌的影响体内增强免疫试验筛选出效果较好的sCAPS2.2和sLBPS1.5.本试验进一步比较了两种硫酸化多糖对新城疫苗免疫雏鸡IFN-γ和IL-10的分泌的影响。14日龄雏鸡330只随机均分为11组,除空白对照组外均用新城疫Ⅳ系苗免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,6个硫酸化多糖组每羽分别注射4、2、1 mg的sCAPS2.2和sLBPS1.5,3个多糖对照组每羽注射1 mg的sAPS、sEPS、sLNT,免疫对照组和空白对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3d。分别于首免后第7、14、21、28 d测定血清抗体效价和外周血淋巴细胞增殖,于首免后第28 d同时测定sCAPS2.2中、低剂量、sAPS和sEPS组血清IFN-γ和IL-10含量的变化。结果显示,SCAPS2.2低剂量、sAPS和sEPS组在所有时间点、其余多糖组在1～3个时间点的淋巴细胞A570值显著大于免疫对照组,sAPS组的淋巴细胞增殖率显著高于、其余多糖组均高于免疫对照组；sCAPS2.2低剂量、sAPS、sEPS和sLNT组在所有时间点、其余多糖组在2～3个时间点的抗体效价显著高于免疫对照组；sCAPS2.2低剂量和sEPS组的IFN-y含量均显著高于免疫对照组,其中sCAPS2.2低剂量组的含量最高；sCAPS2.2中剂量组的IL-10含量最低,其次为sEPS组。以上结果表明,几种修饰多糖均能均能显著增强新城疫苗的免疫应答,促进IFN-y的分泌。综合评价sCAPS2.2低剂量、sAPS和sEPS的作用较强。试验Ⅶ 硫酸化当归多糖对感染CEF的NDV NP基因mRNA表达的影响体内抗病毒试验筛选出效果较好的sCAPS2.2、本试验进一步测定了SCAPS2.2对感染CEF的NDVNP基因mRNA表达的影响,以sAPS和sEPS为对照。培养鸡胚成纤维细胞,待细胞长成单层后,吸出细胞培养液,加入NDV液2 mL,4℃作用30 min,吸出病毒液,分别加入2种浓度的sCAPS2.2、sAPS和sEPS 2 mL,培养72 h后收集细胞,提取总RNA。用Primer Premier软件设计一对特异性NDV引物,扩增出176 bp的NP蛋白基因片段,用实时荧光定量RT-PCR方法测定NDV的相对表达量。结果显示,各硫酸化多糖组的NP基因mRNA的相对表达量均显著小于病毒对照组,sAPS高剂量组的相对表达量最小,其次为sAPS低剂量和sCAPS2.2高剂量组。以上结果表明,3种硫酸化多糖均能显著抑制NDV在CEF中增殖,sAPS的效果较强。