为了解我国重点养殖地区海水养殖源弧菌的流行特征及抗菌药物的耐药现状,本研究对江苏、上海、福建和海南四地区的主要养殖对象(半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Gunther、大菱鲆Scophthatmus maximus、南美白对虾Penaeus vannamei Boone、三疣梭子蟹Portunus tritubrrculatus等)发病样本进行弧菌的分离鉴定,采用琼脂稀释法检测弧菌对16种抗生药物的敏感性;并对本试验中所分离的优势弧菌进行PFGE分子分型,以了解不同来源菌株的亲缘传播关系。随后,通过建立一种多重PCR检测方法,对弧菌中携带的整合子相关元件进行检测,并对其携带的耐药基因盒进行扩增,以探讨整合子相关元件介导弧菌耐药的分子机制。最后,通过对喹诺酮类耐药相关基因qnrVC的检测,从分子层面初步探讨qnrVC基因在弧菌中的流行趋势和传播机制,为水产防治弧菌病中喹诺酮药物的使用提供合理的理论指导。1、海水养殖源弧菌调查与耐药性分析共分离弧菌90株,其中副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus占27.8%(25株)、哈维氏弧菌Vibrio harveyi占23.3%(21株)、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus占8.9%(8株)、创伤弧菌Vibrio vulnificus占10.0%(9株)、鳗弧菌Vibrio anguillarum占4.4%(4株)、灿烂弧菌Vibrio splendidus占4.4%(4株)、霍乱弧菌Vibrio cholerae占7.8%(7株)、其他种弧菌占13.3%(12株)。药敏结果显示,整体上各地区分离株对磺胺甲恶唑、氨苄西林、硫酸新霉素、土霉素的耐药率较高,其中多数的江苏分离株对喹诺酮类(环丙沙星44.7%、诺氟沙星36.8%)、氨基糖苷类(硫酸新霉素52.6%、庆大霉素34.2%)、大环内酯类(红霉素42.1%)药物也表现出较高的耐药水平。耐药基因检出结果:blaTEM-1、carB、cat2、aadA、aacA、strA、strB、sul1、sul2、qnrVC、floR、tetB、tetM、arr基因阳性菌株检出率分别为5.6%、37.8%、1.1%、8.9%、13.3%、23.3%、27.8%、12.2%、30.0%、50.0%、6.7%、14.4%、8.9%、5.6%,而常见的大环内酯类耐药基因(如ermA和ermB)并没有检出。我国水产养殖业中弧菌耐药状况堪忧,多重耐药菌株居多,建议加强对渔药使用的监管,及时指导生产合理用药。2、整合子相关元件多重pcr检测方法的建立及其在弧菌中的流行整合子在细菌耐药性尤其是多重耐药性的转移扩散中起到了非常重要的作用,为了建立一种能同时检测1类整合子、4类超级整合子和1型插入序列共同区的多重pcr检测方法,根据genbank中1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intsxt和1型插入序列共同区转座酶基因iscr1的序列,应用primerplex2.61设计3对特异性引物,通过改变引物浓度和退火温度对多重pcr体系进行了优化。此后,评价了所建立多重pcr体系的特异性和灵敏度,并应用于90株海水养殖源弧菌中三种整合子相关元件的检测。结果显示,设计的3对引物能分别单独且特异性地扩增出569bp、430bp和651bp的目的条带;当int1、intsxt和iscr1三对引物(10pmol/μl)的体积依次为0.3μl、0.6μl和0.6μl,退火温度为50℃时,多重pcr体系能特异性地扩增出三个条带清晰、区分度良好的目的条带,方法的灵敏度达到5ng/μl弧菌基因组模板dna;利用所建立的方法对90株临床分离弧菌进行三种整合子元件检测得到的结果与文献报道的单引物检测结果一致。int1及iscr1可变区携带的耐药基因盒检测结果显示:5株int1阳性菌株可变区均携带同一种耐药基因盒arr-3-dfra27;iscr1阳性菌株可变区耐药基因盒有4种类型,分别是dhfr、cata2、blaper-orfx-aada2和orfx-blapse-4-aada2。该多重pcr方法能快速准确地检测int1、sxt和iscr1,适用于整合子相关元件流行监测及整合子相关的耐药性研究。整合子相关元件携带耐药基因盒出现新的未知功能基因,提示对新型耐药基因的重视,及时阻止超级耐药菌的产生。3、qnrvc基因在弧菌中的流行及其介导的耐药性90株水产养殖源弧菌中共检出qnrvc阳性菌株45株,药敏结果显示:弧菌对喹诺酮类药物的mic值多数分布在0.25-2μg/ml,耐药率基本维持在25%左右,对萘啶酸耐药的弧菌数最多,耐药率达37.8%(34/90)。qnrvc阳性株中有6株表现出对这五种喹诺酮类药物全部耐药,19株阳性株表现出对检测的五种喹诺酮类药物完全敏感,耐药状况并不严重。选择的两株阳性株接合转移试验均成功,接合子的mic值均有一定提升。qnrvc阳性的副溶血弧菌和哈维氏弧菌的pfge分型结果显示:这两种弧菌菌株间仅有几株间有同源性,但均无流行病学相关性,呈散发流行趋势。结论:弧菌中qnrvc基因的流行,不仅涉及种类、地域广,且该基因不仅存在于耐药菌株上,很多敏感菌株亦有携带;并可通过结合质粒转移,进行水平传播,并提高接合子对喹诺酮类的耐受性;携带qnrVC的副溶血弧菌和哈维氏弧菌呈散发流行趋势。