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研究背景及目的随着冷冻电镜硬件上的突破,尤其是直接电子相机的问世,以及软件方面如图像的处理和算法的改进,单颗粒冷冻电镜技术已经发展成为结构生物学中研究生物大分子(包括病毒)三维结构最常用的手段。二十面体病毒自身具有极好的对称性及合适的分子量范围,一直是冷冻电镜解析结构的热点。传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是一种二十面体dsRNA病毒,该病毒引起的鸡传染性法氏囊病给全球养殖业带来了巨大的经济损失。目前关于该病毒的结构研究多关注在其衣壳表面,病毒衣壳内基因组及其核酸转录酶的相关信息还不清楚。本实验主要研究IBDV生理条件下三维结构并通过该结构获得IBDV衣壳内部基因组及核酸转录酶的包装信息。猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病(Porcine circovirus disease)和猪圆环病综合征(porcine circovirus-associated diseases,PCVD)的病原体。PCV2病毒粒子直径～15 nm,基因组为单股环状负链DNA。虽然目前已经成功获得了 PCV2VLP的晶体结构,但该空衣壳结构不含病毒核酸,并不能完全代表生理状态的包含基因组的PCV2结构,也不能用于研究病毒衣壳蛋白与核酸间的相互作用。本课题利用冷冻电镜开展对PCV2完整病毒的结构学研究,分析核酸与病毒蛋白衣壳的相互作用,为了解PCV2致病机制提供了结构信息。方法(1)通过IBDV感染DF-1细胞分离纯化得到IBDV颗粒。(2)应用IFA检测纯化的IBDV颗粒的完整性。(3)利用冷冻电镜技术结合三维重构方法解析IBDV三维结构,并与其他dsRNA病毒结构进行比较。(4)利用冷冻电镜技术解析PCV2三维结构。结果(1)获得了高纯度、均一性良好的IBDV颗粒。(2)IFA结果显示感染纯化的IBDV的DF-1细胞与抗VP5单抗作用,在细胞上产生绿色荧光。(3)解析了 IBDV完整病毒粒子约6.6 A分辨率的三维结构。(4)解析了 PCV2完整病毒粒子2.97 A分辨率的三维结构。结论(1)IBDV T=13单层病毒衣壳由260个VP2三聚体蛋白组成,VP2三聚体在衣壳表面采取五种不同构象分布。同时IBDV衣壳内部观察不到dsRNA病毒特征性的基因组密度和病毒核酸转录酶电子密度,统计分析表明IBDV内部核酸包装密度明显低于其他dsRNA病毒,结果暗示IBDV的基因组采用了不同于其他dsRNA病毒基因组的组装方式。(2)PCV2为无囊膜二十面体病毒,T=1单层衣壳由Cap(Capsid Protein)蛋白组成。PCV2完整病毒三维结构表明PCV2衣壳蛋白与核酸的相互作用影响了衣壳蛋白的局部构象。衣壳五次轴处带正电氨基酸残基与5次轴孔道内的核酸作用,暗示病毒核酸的释放与五次轴处的孔道相关。