传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,是严重危害养鸡业的重大传染病之一。IBV是禽类一种变异性很强的冠状病毒,传播迅速、血清型众多,不同的血清型之间缺乏交叉保护。IBV的蔓延对全球家禽业造成了严重的损失。N蛋白是诱导机体免疫应答的重要免疫原蛋白,N基因具有高度的保守性。本研究以IBV N蛋白为研究对象,制备了针对N蛋白的单克隆抗体,对IBV的预防、诊断及控制具有一定的意义。本实验将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,反转录为cDNA。设计一对特异性引物对N基因进行扩增,片段大小为1230bp,将其与克隆载体pMD19-T连接并转入DH5α感受态细胞并保存菌种,将其与表达载体pGEX-6p-1连接并转入Transetta(DE3)感受态细胞,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳分析重组N蛋白大小约为79kD,用GST柱纯化重组N蛋白,加入PreScission Protease切除GST标签,Western-blot检测N蛋白的抗原性,结果显示N蛋白有较好的抗原性。采用纯化的N蛋白对BALB/c小鼠进行免疫,通过间接ELISA方法检测,选取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞进行细胞融合。通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过三轮亚克隆获得了13株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,其中8株能与IBV结合。选择效价高且能与IBV结合的1A12C5细胞株,通过小鼠体内诱生腹水法大量制备抗N蛋白的单克隆抗体,收集腹水用正辛酸-硫酸铵法对其进行纯化,SDS-PAGE电泳结果表明该单抗纯度比较高。1A12C5单克隆抗体重链为IgG2b,轻链κ型。纯化后的1A12C5单抗效价可以达到1:1.64×10~6,亲和力常数为1.87×10~7 L/mol。特异性鉴定结果表明1A12C5仅与IBV特异性结合。1A12C5单克隆抗体能与不同血清型的IBV反应。稳定性鉴定表明1A12C5单克隆抗体具有良好的传代稳定性。本试验成功制备了13株抗IBV N蛋白单克隆抗体其中8株可以与IBV结合,为进一步研制IBV诊断试剂奠定了基础。