土壤细菌抑制绿僵菌作用机理的初步研究

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绿僵菌(Metarhizium spp.)是一种分布广泛、寄主多样的昆虫病原真菌,在农林害虫微生物防治中扮演着重要的角色,平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)wp08菌株对竹林优势种筛胸梳爪叩甲(Melanotus cribricollis)幼虫(即金针虫)具有较高毒力,但田间防治效果不佳,土壤的抑真菌作用是影响该菌防效的主要原因之一。为探究土壤对绿僵菌的抑制作用,本文测定了土壤对绿僵菌wp08菌株的抑制效果,并从土壤中分离出对绿僵菌wp08菌株有抑制作用的不动杆菌,利用SPME-GC/MS法分析鉴定其挥发物中具有抑菌活性的化合物,确定了不动杆菌的代谢产物及挥发物是其抑制绿僵菌萌发的主要因素。并利用高通量测序技术,分析了绿僵菌与土壤细菌群落变化的关系,为研究土壤对绿僵菌的抑制作用及改善绿僵菌田间防效提供一定的基础信息。研究主要内容及结果如下:1.分别在培养16 h、24 h、36 h、48 h后,测定土壤对绿僵菌wp08菌株孢子萌发的影响,经统计各个时段绿僵菌wp08菌株孢子在非灭菌土与灭菌土中的萌发率均表现出显著性差异(P<0.05)。从分离自土壤的54株细菌中筛选出了8株对绿僵菌wp08菌株孢子萌发率有显著抑制作用的菌株。经鉴定8株细菌均属于不动杆菌(Acinetobacter),受其挥发物抑制,绿僵菌wp08菌株孢子在培养48 h时,萌发率不足30%,对照萌发率为96.4%。在含有细菌发酵液的培养基上,萌发率随发酵液浓度的增加而下降,在培养96 h后,最低萌发率仅为6%。其挥发物对绿僵菌wp08菌株菌丝生长无明显影响,发酵液对菌丝有抑制作用,两者对产孢量影响差异不显著。将发酵液加到土壤中后,绿僵菌wp08菌株对筛胸梳爪叩甲幼虫毒力下降,LT50从12.7 d上升到20.9 d。2.通过GC-MS分析,从不动杆菌发酵液的挥发物中共鉴定出21种化合物,主要包括芳香族化合物(76.4%)、烷烃类(7.32%)、烯烃类(3.06%)、酮类(6.1%)、醌类(1.69%)。其中二丁基羟基甲苯、莰酮、苯并噻唑、苯胺等可能是不动杆菌抑制绿僵菌wp08菌株的活性物质。3.通过Miseq高通量测序平台研究了施入绿僵菌后,土壤细菌群落结构的变化,分别从门、科、属的水平上分析了优势群落随取样时间的变化。优势菌群变形菌门、酸杆菌门、放线菌门群落丰度变化差异不显著(P>0.05),而绿弯菌门在60 d时群落丰度显著提高(P<0.05)。在科水平上菌群Proteobacteria_unclassified随取样时间发生了显著降低(P<0.05)。在属水平上JG30-KF-AS9_norank在60 d时相对丰度显著高于其他取样时间(P<0.05)。
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