研究背景:急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一组血液系统恶性疾病,其通过多基因突变和染色体重排从而导致造血前体细胞克隆性转化[1]。近年来尽管临床针对AML的治疗已经取得了很大进展,但是其预后依然很不乐观,5年生存率仅仅为25%[2]。因此对于探讨AML疾病的发生发展机制,寻找新的生物靶点具有非常重要的临床价值及意义。环状RNA（circular RNAs,circRNAs）是一类广泛表达的非编码RNA分子,其在多种真核生物中产生,比如植物、动物、原核生物和酵母等等[3-5]。近年来,circRNAs被认为是RNAs领域的最新研究热点[6]。其与传统的线性RNAs（包含5’和3’末端）不同点在于,circRNAs呈闭合环状结构,很难被RNA外切酶降解,因此表达更稳定[6-8]。circRNAs的发生是通过反向剪接而形成,这是一种非经典剪接方式[3]。一种模型认为,位于内含子区域的反向互补序列导致内含子区域配对介导反向剪接从而形成环形RNA分子;另一种模型认为pre-RNA的转录过程中由于RNA发生部分折叠,拉近了原本非相邻的外显子,从而发生外显子跳跃,使得被跨越的区域形成环形RNA中间体,进一步通过套索剪接形成由外显子构成的环形RNA分子[9,10]。据相关文献报道,circRNAs具有细胞特异性,其在脑中以及人体血液中都表达相对丰富[11]。circRNAs与其来源的线性RNAs的关系很复杂。有报道称,circRNAs是在与线性RNAs竞争中产生的[12]。然而,也有报道称circRNAs和线性RNAs之间没有明确的相关性[13]。circRNAs含有丰富的microRNAs（miRNAs）结合位点,从而经过海绵吸附作用在细胞中发挥着及其重要的作用。即circRNAs通过与某些miRNAs进行海绵吸附,所以能够消除miRNAs对靶基因的抑制作用,从而提高靶基因的表达水平[7]。这种机制被称为竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）[7,8]。此外,circRNAs还具有多种功能,包括转录调控、蛋白质的分离和转运以及短蛋白的产生[14-16]。由于circRNAs能够与疾病相关的miRNAs相互作用,所以在各种疾病中发挥着极其重要的调控作用。因此对于circRNAs的相关研究引起了人们的极大关注。有相关研究表明,circTADA2As海绵吸附miR-203a-3p进而抑制乳腺癌的进展和转移[17];circPSMC3作为miR-296-5p的海绵吸附位点抑制胃癌的增殖和转移[18]。此外,circOMA1介导miR-145-5p抑制无功能垂体腺瘤的肿瘤生长[19]。这些结果均表明,circRNAs可能是一种新的实体瘤诊断标志物和治疗靶点。然而,迄今为止,关于circRNAs在血液系统疾病中的作用,特别是在AML中的作用,鲜有报道。有研究表明,下调circ₀009910,从而增加miR-20a-5p进而抑制急性髓性白血病细胞的生长[20]。我们前期研究发现,hsa_circ₀004277可以作为AML一个新的生物标志物和治疗靶点。特别是,我们发现化疗可以显著恢复hsa_circ₀004277的表达水平,表明hsa_circ₀004277水平的升高与治疗相关[21]。尽管有诸多研究,但circRNAs在AML发生发展的具体作用机制仍然不确定。在本研究中,我们研究了hsa_circ₀001947在AML发生发展中的作用及可能机制,发现hsa_circ₀001947通过 hsa_circ₀001947-hsa-miR-329-5p-CREBRF 网络在 AML 中发挥抑癌作用,可能成为AML的潜在治疗靶点。研究目的:本研究旨在进一步验证hsa_circ₀001947在AML病人以及正常对照骨髓的差异性表达;进一步阐明 hsa_circ₀001947-hsa-miR-329-5p-CREBRF 网络在 AML中的抑癌作用,并可能为AML的治疗提供新的靶点。研究方法:circRNAs基因芯片确定差异表达谱。定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测 hsa_circ₀001947表达情况。siRNA验证hsa_circ₀001947的体内外功能。双荧光素酶报告实验和mimics/inhibitor 检测 hsa-miR-329-5p 与 CREBRF 的靶基因关系。研究结果:1.AML患者中的circRNAs表达谱:根据差异性变化倍数及其P值,选择了两种circRNAs,分别是表达上调的hsa_circ₀058058和下调hsa_circ₀001947作为候选研究对象。2.hsa_circ₀001947在AML患者的表达:与健康对照相比,初诊（Newly diagnosed,ND）AML 患者或复发难治性（Relapsed-refractory,RE）AML 患者中hsa_circ₀001947的表达水平低,而完全缓解（Complete remission,CR）患者中hsa_circ₀001947的表达水平升高。3.AML 中 hsa_circ₀001947 的特征:来源于AFF2,耐受RNase R酶,比AFF2稳定。4.hsa_circ₀001947在AML患者中的临床特征:4.1 AML 患者中 hsa_circ₀001947 的表达水平与白细胞（white blood cell,WBC）,BM%（The percentage of primitive cells in bone marrow,BM%）或 PB%（The percentage of primitive cells in peripheral blood,PB%）呈负相关,与血红蛋白（hemoglobin,HGB）呈正相关。4.2 qRT-PCR检测显示表达下调的hsa_circ₀001947在化疗后表达水平得以恢复。5.hsa_circ₀001947 的 ROC（Receiver-operating characteristic,ROC）曲线分析:ROC曲线分析结果表明,hsa_circ₀001947在临床上具有重要的诊断价值。6.体内外实验证明hsa_circ₀001947对AML细胞有抑制作用:6.1体外:Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞增殖,结果表明,与阴性对照比,下调组可以促进THP-1细胞增殖;流式细胞术检测凋亡,结果显示,与阴性对照组比,下调组对Cytosine arabinoside（Ara-c）诱导的药物敏感性降低,细胞凋亡率减少,表明hsa_circ₀001947对AML细胞有抑制作用。6.2体内:关于肿瘤体积与重量的比较:下调组均明显大于阴性对照组。抗体Ki67染色肿瘤细胞,结果显示,与阴性对照组相比,下调组的增殖高于阴性对照组;流式细胞术检测凋亡,结果显示,下调组的细胞凋亡率低于阴性对照组细胞凋亡率。实验结论:1.circRNAs芯片结果展示了 AML患者circRNAs表达谱。2.hsa_circ 0001947在AML中具有特异性表达,可作为潜在的AML诊断指标和治疗靶点。3.小干扰下调hsa_circ₀001947促进THP-1细胞增殖并抑制凋亡,降低对Ara-c诱导的药物敏感性。4.转染hsa-miR-329-5p mimics,增殖没有统计学差异,但对Ara-c诱导的药物敏感性降低;转染hsa-miR-329-5p inhibitor,抑制THP-1细胞增殖,增加对Ara-c诱导的药物敏感性。5.hsa_circ₀001947-hsa-miR-329-5p-CREBRF 网络在 AML中发挥抑癌作用。