海洋细菌中有机氮降解与光能吸收关键蛋白的结构与功能研究

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物质循环和能量流动是海洋生态系统运转的两个基本过程。在海洋生态系统中,氮循环是海洋物质循环的重要环节。海洋生态系统运转所需要能量主要来自海洋中藻类光合作用固定的太阳能。海洋微生物是推动海洋生态系统氮循环和光能固定的重要力量。研究和阐明海洋微生物参与氮循环与能量固定过程的关键蛋白的结构与功能,有助于揭示海洋生态系统运转的内在机理,从而为海洋资源的合理开发与海洋环境的保护提供理论依据。本文利用晶体结构解析、生化分析以及计算机模拟等手段对深海细菌参与氮循环的两个蛋白酶以及蓝藻中参与光能传递和转化过程的关键蛋白的结构和功能进行了研究,为阐明海洋微生物参与氮循环与能量固定过程的分子机制提供了重要理论依据。1. Thermolysin家族金属蛋白酶自成熟机制的研究Thermolysin家族是金属蛋白酶中一个非常重要的大家族,该家族的酶大多是细菌胞外蛋白酶,在环境有机氮的降解和地球氮循环中发挥着重要作用。Thermolysin家族金属蛋白酶(TLPs)在成熟过程中首先合成为一个没有活性的酶原,然后经过一个特定的自激活(autoprocessing)过程才能成为一个有活性的蛋白酶。由于缺少对TLPs成熟中各个中间体结构的解析,TLPs成熟的分子机制一直不清楚。许多海洋细菌都能分泌TLPs用于胞外有机氮的降解,这些TLPs在海洋氮循环中发挥着关键作用。MCP-02是深海适冷菌Pseudoalteromonas sp. SM9913分泌的一个金属蛋白酶。研究表明,MCP-02是一个典型的TLP。本部分以MCP-02为模型,通过突变和结晶,在国内外首次解析了TLP成熟中剪切后复合体的结构,并通过结构分析、生化突变实验和计算机模拟等详细研究了TLPs自成熟的分子机制。我们首先重组表达了MCP-02,并对其成熟酶进行了结晶和晶体结构解析(1.7A)。MCP-02成熟酶有着同Thermolysin (Thermolysin家族的原型)非常相似的结构,都由一个氮端结构域(N-terminal Domain, NTD)和一个碳端结构域(C-terminal Domain, CTD)构成。为了得到稳定的酶原或剪切后复合体用于结构研究,我们在MCP-02活性中心附近设计了一系列的突变。最终,获得了两个剪切后复合体的晶体结构(E346A和E369A)。在剪切后复合体中,MCP-02的前导肽呈现一个巨大的“C”型结构环绕在CTD上。前导肽同催化结构域之间拥有很大的相互作用面(1541.98A2),其间存在着大量的氢键、盐键以及少量的疏水相互作用。另外,前导肽的碳末端深入到了催化结构域的活性中心中,最末端的His204取代了成熟酶中活化水分子而成为活性中心锌离子的第四个配位基,从而抑制了催化结构域的蛋白酶活力。在剪切后复合体中,我们还发现催化结构域的第一个氨基酸Ala205同在酶原中共价连接的His204分开了大约33A的距离,同时Ala205-Ser212之间的8个氨基酸形成一个新的β-折叠片插入到催化结构域氮端一个相对独立的结构域中。为了进一步研究这个过程,我们模拟计算了MCP-02酶原的结构。通过计算自由能发现,MCP-02酶原的能量远高于其剪切后复合体的能量,而且酶原的Tm值比剪切后复合体的Tm值高大约20℃。这些都表明从酶原到剪切后复合体的构象变化是一个由自由能驱动的过程。通过对前导肽被催化结构域降解形成的片段进行氮端测序,我们发现催化结构域对前导肽的切割是从两个位点开始的(Ser49-Va150和Gly57-Leu58)。结构分析与生化实验表明,这两个位点的切开会破坏FTP结构域的疏水核心,进而导致前导肽同催化结构域的解离,最终使蛋白酶MCP-02完全激活。由于MCP-02是一个典型的TLP,而且大部分的TLPs具有相似的序列和结构,根据以上的研究结果,我们提出了Thermolysin家族金属蛋白酶成熟分子机制的模型。2.MCP-01胶原蛋白酶催化结构域识别降解胶原蛋白的分子机制胶原蛋白是海洋有机氮的重要组成成分,胶原蛋白的微生物降解也是海洋氮循环中的重要一环。MCP-01是深海细菌Pseudoalteromonas sp. SM9913分泌的一个丝氨酸蛋白酶。研究表明MCP-01是一个S8家族丝氨酸胶原蛋白酶。虽然目前在S8家族中已报道数个胶原蛋白酶,但这些酶识别和降解胶原蛋白的机制还不清楚。为了揭示MCP-01的催化结构域(catalytic domain, CD)识别和降解胶原蛋白的分子机制,我们通过X-射线衍射的手段解析了MCP-01CD的晶体结构。通过结构分析、序列比对和生化突变实验,我们发现MCP-01CD底物结合口袋周围的三个loop参与了胶原蛋白分子的识别,且这三个loop上含有的大量芳香族氨基酸和酸性氨基酸。对这三个loop上的芳香族氨基酸和酸性氨基酸的点突变实验表明这些氨基酸在识别胶原蛋白中起到了重要作用。通过与S8家族其它胶原蛋白酶和非胶原蛋白酶进行序列比对发现,底物结合口袋周围的三个loop上芳香族氨基酸和酸性氨基酸增多是S8家族丝氨酸胶原蛋白酶的一个共同特征,这进一步表明,这些loop以及上面的芳香族氨基酸和酸性氨基酸在S8家族胶原蛋白酶对胶原蛋白底物的结合中发挥着重要作用。另外,为了阐明MCP-01CD对胶原蛋白的降解机制,我们对MCP-01CD降解可溶性多肽底物与胶原蛋白的位点偏好性进行了分析,结果表明MCP-01CD并不具有很强的底物切割位点特异性,这有利于MCP-01CD对胶原蛋白的快速降解。我们的研究首次揭示了S8家族丝氨酸胶原蛋白酶识别降解胶原蛋白底物的分子机制,对进一步了解胶原蛋白的微生物生物降解过程具有一定帮助。3.蓝藻藻胆体杆组装的分子机制藻胆体是海洋蓝藻与陆地淡水蓝藻的光能捕捉复合体,是光合作用中能量固定的第一步。蓝藻藻胆体主要由藻胆蛋白和少量连接蛋白构成。连接蛋白在藻胆体的组装和能量传递中起重要作用。蓝藻连接蛋白中共包含三个结构域:Pfam01383结构域、Pfam00427结构域和Pfam00502结构域,除Pfam01383结构域以外,另外两个结构域在蓝藻中行使其功能的结构基础一直不清楚。本部分首先解析了Pfam00427结构域的晶体结构,并在此基础上通过生化突变实验和分子动力学模拟等研究了蓝藻藻胆体杆组装的分子机制。我们首先重组表达了模式蓝藻Synechocystis sp. PCC6803中Pfam00427结构域,然后对其进行了蛋白纯化和结晶,并用3-碘-酪氨酸取代的方式解析了Pfam00427的晶体结构(1.9A)。总体上,Pfam00427结构域包含有6个α-螺旋,且α3和α6的C末端具有一个小的扭曲。Pfam00427结构中的6个α-螺旋排列成一种特殊的点对称结构。通过利用DALI服务器对Protein Data Bank搜索发现,Pfam00427结构域代表了蛋白质折叠中的一种新的折叠类型(fold)。为了研究Pfam00427如何结合在C-PC(αβ)6(C-phycocyanin)的中央空腔内,我们运用软件AutoDock模拟了Pfam00427-C-PC (αβ)6的结构。同时,采用GST pull-down技术研究了Pfam00427同C-PC之间的相互作用。通过大量的突变实验发现,Pfam00427主要通过一块保守“C-PC结合区域”同C-PC相互作用。基于这些生化分析,我们对对接结果中最为合理的一个模型进行了分子动力学模拟,最终得到了Pfam00427-C-PC (αβ)6的结构模型。我们进一步把模拟的LRT(即Pfam01383结构域)通过比对放入到Pfam00427-C-PC (αβ)6模型中,得到了蓝藻藻胆体杆的最基本单元Pfam01383-Pfam00427-C-PC (αβ)6的模型。然后,我们把这种组装方式运用到了整个藻胆体杆上,得到了蓝藻藻胆体杆组装的精细模型。在这个模型中,连接蛋白LR跨越两个(αβ)6将其连接起来,很好地解释了连接蛋白是如何介导藻胆体杆的组装的。我们基于Pfam00427的晶体结构、生化分析和计算机模拟提出的蓝藻藻胆体杆的精细分子模型,首次从蛋白质分子结构层面上揭示了藻胆体杆的组装机制,并对前人提出的模型进行了细化和修正,这对于进一步详细了解整个藻胆体的组装方式具有很大帮助。4.LcM氮端结构域Pfam00502自色素化机制及藻胆体末端能量受体的分子模型在蓝藻藻胆体核心部分中,存在着一个重要的连接蛋白LCM。LCM是藻胆体末端能量受体(αβ)2(LCMβ18)(Terminal Energy Acceptor, TEA)的主要组成部分,负责从藻胆体向光系统Ⅱ传递能量。LcM的氮端具有一个藻胆蛋白类似结构域Pfam00502(LP502)。研究表明,LP502结构域能够发生自色素化。然而,LP502自色素化的机制和TEA详细的结构信息一直不清楚。本部分对这些问题进行了研究。通过一系列的突变实验,我们发现自色素化是LP502独有的性质。LP502的自色素化位点不能被转移,同样,其它藻胆蛋白也不能通过突变而自色素化。通过测量不同LP502突变体同藻胆素PCB (phycocyanobilin)孵育后的光谱吸收变化和进行锌离子染色电泳分析发现,LP502的两个突变体S152A和C190S能够特异性地结合藻胆素PCB分子而不与之共价交联。这表明LP502自身能够不依赖裂合酶而准确地识别PCB分子,这解释了LP502为什么能够自色素化。为了寻找PCB分子在LP502上的结合口袋,我们对LP502上的一系列氨基酸进行了突变。结果表明,PCB在LP502上的结合口袋同其在APC(allophycocyanin) α-亚基上的结合口袋是一致的,且Arg154和Asp155两个氨基酸在结合PCB分子上起着关键作用。基于这些生化研究,我们使用计算机模拟的手段建立起了一个LP502-PCB复合体的结构模型。在这个模型中,PCB结合于LP502上一个大而深的口袋中,而且PCB的A环旋转了大约70度,D环则旋转了接近90度。详细的结构分析表明,Ser152与PCB的A环也形成了一个氢键,使得PCB的A环上的亚甲基朝向Cys190而促进了硫醚键的形成。如果将Ser152突变为Cys,将会导致LP502色素化复合体的最大吸收峰由667nm蓝移到了646nm,这表明Ser152对维持LP502的特征吸收光谱具有重要作用。在蓝藻藻胆体中,偶极-偶极相互作用对于其能量传递至关重要。然而,对于末端能量受体(αβ)2(LCMβ18)三聚体中的偶极-偶极相互作用却知之甚少。基于我们的研究结果和文献,我们对末端能量受体中的偶极-偶极相互作用进行了分析。与APC(αβ)3不同,末端能量受体中的三个偶极均不相同:偶极1由β18和(?)APC α-亚基构成,序列比对表明β18-亚基缺失了两个同APC α-亚基上色基PCB分子相互作用的氨基酸残基,这一点可能导致APC α-亚基上PCB分子的构象改变,进而影响其光谱吸收;偶极2与目前已经解析的APC(αβ)3中的偶极完全一致;偶极3由LP502和APC β-亚基构成,LP502上的色基PCB分子呈现一种特殊的构象,导致其吸收光谱较其它藻胆蛋白不同。
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