【摘 要】
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PM2.5可诱导活性氧过度释放,引起氧化/抗氧化系统失衡,对遗传物质产生毒性作用和不可逆损伤。鹰嘴豆芽素A（BCA）可以有效干预PM2.5所致损伤。XRCC1/BER信号通路可参与机体DNA损伤修复过程,缓解外界环境所造成的DNA损伤。本论文通过CRISPR/Cas9技术建立体外敲除模型,并结合q RT-PCR、Western blot等技术分析XRCC1缺失对BER/DNA损伤修复信号通路的影响
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PM2.5可诱导活性氧过度释放,引起氧化/抗氧化系统失衡,对遗传物质产生毒性作用和不可逆损伤。鹰嘴豆芽素A（BCA）可以有效干预PM2.5所致损伤。XRCC1/BER信号通路可参与机体DNA损伤修复过程,缓解外界环境所造成的DNA损伤。本论文通过CRISPR/Cas9技术建立体外敲除模型,并结合q RT-PCR、Western blot等技术分析XRCC1缺失对BER/DNA损伤修复信号通路的影响,阐明BCA缓解PM2.5所致DNA氧化损伤的作用机制。基于人源支气管上皮（BEAS-2B）细胞,通过在线工具完成sg RNA设计与引物合成,构建Pg K1.1-XRCC1重组质粒,采用电转染方法将CRISPR/Cas9载体导入野生型BEAS-2B细胞,并经凝胶电泳、测序、TA克隆、表型比对、蛋白定量检测等多种方法验证其敲除效果,成功获得XRCC1基因敲除细胞。在此基础上,基于BEAS-2B野生型细胞与XRCC1敲除型细胞,建立PM2.5暴露-BCA保护体外细胞模型,评价PM2.5致细胞损伤毒性与BCA的干预作用,并对天津市PM2.5进行物理表征,明确其主要致毒成分与最适给药浓度为150μg/m L。BCA基于XRCC1缓解PM2.5所致DNA氧化损伤研究结果表明:PM2.5处理可促进BEAS-2B野生组与XRCC1敲除组细胞乳酸脱氢酶释放量（分别上调至对照组的2.48倍于2.15倍）、C反应蛋白释放量（分别上调至对照组的1.43倍于1.26倍）、8-羟基脱氧鸟苷释放量（分别上调至对照组1.54倍与1.31倍）,显著抑制细胞活力,诱发细胞急性氧化应激,加重DNA氧化损伤水平,而40μM BCA可以有效抑制上述变化;但在XRCC1敲除组中,XRCC1的缺失显著干预BCA的保护作用。结合Western Blot和q RT-PCR技术探究BCA发挥保护作用的信号通路,结果发现:PM2.5染毒处理抑制野生型细胞中XRCC1、PARP1、OGG1、APE1、PCNA等BER通路蛋白表达（抑制率分别为77%、67%、65%、75%、72%、83%）及NER/DNA损伤修复通路中p53蛋白的表达,诱导ERCC1基因过表达,而BCA可抑制上述蛋白的显著差异表达;在XRCC1敲除型细胞中,PM2.5虽对各BER通路蛋白具有显著影响,但BCA未表现明显的干预作用。系统地验证了XRCC1在BCA缓解PM2.5所致肺细胞氧化应激损伤过程中发挥关键作用,从而阐明BCA缓解PM2.5致DNA氧化损伤作用机制。
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