【摘 要】
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左聚糖（levan）是一种由β-D呋喃果糖聚合而成的天然果聚糖,具有预防龋齿、控制体重、调节肠道菌群等功能,有良好的应用前景。天然来源的左聚糖产量低、成本高,极大地限制了其工业应用。本文拟采用基因工程技术克隆表达果聚糖蔗糖酶基因,进而体外合成左聚糖,为实现其大规模生产提供依据。本实验从东北大酱中筛选出一株高产糖菌株,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）,命名为BM-2。
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左聚糖（levan）是一种由β-D呋喃果糖聚合而成的天然果聚糖,具有预防龋齿、控制体重、调节肠道菌群等功能,有良好的应用前景。天然来源的左聚糖产量低、成本高,极大地限制了其工业应用。本文拟采用基因工程技术克隆表达果聚糖蔗糖酶基因,进而体外合成左聚糖,为实现其大规模生产提供依据。本实验从东北大酱中筛选出一株高产糖菌株,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）,命名为BM-2。通过PCR克隆了BM-2果聚糖蔗糖酶基因,将其插入含有Acma纯化标签的表达质粒,成功构建重组质粒pET-32a-lsc-Acma-zz,转化至E.coli BL21（DE3）进行异源表达。对转化子诱导重组果聚糖蔗糖酶（BM-lsc）的生产条件进行优化。结果显示,在菌株起始浓度(OD600 nm)为0.4、IPTG诱导浓度为0.1 m M、诱导温度为25℃时表达分泌效果最好。将超声破碎处理后的粗酶液与细菌增强子基质（BEM）孵育结合,实现了BM-lsc的一步纯化,并在SDS-PAGE电泳中显示单一清晰的条带,分子量约为54 k Da。纯化后的酶浓度为0.1025±0.0021 mg/m L,纯化效率为93.4%。对BM-lsc的酶学性质进行了研究。BM-lsc最适pH为5.6,最适温度为50℃,金属离子对BM-lsc酶活性影响较大。在0.8-3.6 M NaCl溶液中,BM-lsc仍能保持80%以上的酶活。BM-lsc对蔗糖的米氏常数（Km）为17.41 m M,Vmax为16.76 umol·s-1,转化数(kcat)为376.83 s-1,催化常数(kcat/Km)为21.64 m M-1·s-1。这些结果表明,BM-lsc与蔗糖的亲和力高,可高效催化左聚糖的合成,并对高温、高渗透压具有强的耐受性。经鉴定,BM-lsc体外催化的产物,是由摩尔比为99:1的果糖:葡萄糖组成,分子量为2.55×10~6 Da,表明产物为左聚糖。对体外催化产糖条件进行了优化,当加酶量和蔗糖浓度分别为20 U/g和400 g/L,经18 h反应平衡后左聚糖的产量达120 g/L,转化率约为30%。为了更好地理解果聚糖蔗糖酶的催化机制,预测功能位点和保守性氨基酸,对BM-2果聚糖蔗糖酶基因进行了生物信息学分析。同源建模显示该酶呈典型的GH68族的晶体结构,由5个反平行β-折叠组首尾相连形成“漏斗”,利于底物的进入及果糖链的延伸。分子对接显示,氨基酸残基Asp86,Arg246和Asp247,Glu340和Arg360组成的催化三联组,可能分别起着亲核组、过渡态稳定组以及提供酸/碱质子的作用,是潜在的控制酶活和产物的关键性氨基酸。本论文克隆表达了BM-2果聚糖蔗糖酶基因,表达效率高,纯化方法简单。将异源表达的工程酶用于体外左聚糖合成,实现了其高效生产。并对果聚糖蔗糖酶的催化机制进行了初步分析。研究成果为左聚糖的大规模生产提供了依据。
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