N-乙酰氨基葡萄糖提高草莓糖含量的原理及应用

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糖是植物果实生长发育的基础物质,其种类和含量是衡量果实品质的重要指标,也是果实品质特征成分和风味物质。同时,糖还具有其它的生物学功能,可作为信号分子在植物代谢、生长发育和胁迫响应中起调节作用。basic leucine-zipper(bZIP)蛋白在调节果实相应外界环境和体内糖信号中发挥重要功能。本试验利用森林草莓(Fragaria vesca)基因组数据对草莓bZIP转录因子进行全基因组鉴定和分析,选定basic leucine-zipper 28(bZIP28)基因通过半定量及荧光定量分析了其时空表达模式以及对蔗糖的响应情况;利用离体注射法过表达了草莓bZIP28基因,并测定过表达后果实中总糖和蔗糖含量;利用拟南芥和烟草深入探究了bZIP285’端非编码区u ORF的蔗糖诱导翻译抑制(SIRT)效应,认为该抑制作用是限制果实糖含量增加的因素之一。而该抑制效应是通过糖信号响应因子己糖激酶HXK来实现的。进一步,采用不同浓度的HXK抑制剂N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)处理发育到1/4红时期的草莓果实,进一步探究该应用对草莓果实品质的影响。研究结果如下:1、根据二倍体草莓基因组数据,发现草莓基因组中至少存在52个bZIP基因家族成员,不均地分布在7条染色体上。根据蛋白质序列的分析及建树聚类情况将整个家族分为10个亚类。2、根据NCBI数据库中森林草莓FvbZIP28的mRNA预测序列(XM_004300404),同源克隆获得了栽培草莓‘丰香’bZIP28基因全长编码序列;利用半定量及荧光定量PCR技术对bZIP28基因进行表达模式分析。研究结果表明:FabZIP28基因在草莓在不同组织部位与果实发育各个时期均有表达。基因在花器官中表达水平相对较高,而在根、茎、匍匐茎和叶等组织中基因表达水平相对较低;FabZIP28基因在果实全红期(FR)的表达水平最低,其他时期表达水平较高,无显著差异。通过不同浓度蔗糖处理,FabZIP28基因的表达无明显变化。结果表明FabZIP28在花器官特异表达,外源蔗糖对该基因的转录水平无正相关。3、FabZIP28的5’UTR区存在3个不同长度的开放阅读框,介导了上游开放阅读框(u ORF)依赖的蔗糖翻译抑制。成功构建35S::Δu ORF-bZIP28过表达载体,通过注射法侵染离体草莓果实,成功过表达bZIP28基因。通过生理水平检测,过表达果实会提前成熟,同时蔗糖含量增加约20%,总糖含量也会提高,说明bZIP28因子是蔗糖合成途径中的正调控因子。4、构建35S::uORF-GUS过表达载体,通过农杆菌介导的浸花法成功获得转基因拟南芥株系,同时构建了u ORF起始密码子定点突变的过表达载体,通过农杆菌介导,注射烟草叶片,获得瞬时表达的烟草叶片,并检测蔗糖和葡萄糖的抑制效应。蔗糖会抑制转基因拟南芥中的GUS活性,葡萄糖在有光条件下也会抑制GUS活性。在烟草中得到同样的结果。且u ORF中的第二个开放阅读框起始密码子的正确翻译可以决定是否具有SIRT效应。以上结果说明草莓bZIP28的u ORF具介导蔗糖诱导的翻译抑制效应,同时也具葡萄糖诱导的翻译抑制效应,此效应可能通过糖信号途径进行感知。5、己糖激酶HXK是糖信号转导的关键环节,根据上述结果我们认为:在糖积累达到平台期时,解除HXK糖信号转导可以进一步提高糖含量。试验进一步选取HXK抑制剂之一:N-乙酰氨基葡萄糖不同浓度对草莓果实进行喷施处理,以较高浓度(100 m M)喷施糖积累接近完成的1/4红时期草莓果实,以清水为对照,3天后采样(果实符合商品成熟标准)并测定果实部分品质指标。结果表明:果实总糖和果糖略提高,但与对照差异未达到显著水平,而蔗糖含量显著高于对照;花青素苷和总酚也显著高于对照;抗坏血酸、类黄酮、葡萄糖含量显著低于对照。结果表明N-乙酰氨基葡萄糖可以有效抑制葡萄糖合成,可以提高蔗糖含量。
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