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我国是世界上大蒜生产及出口大国。大蒜历来被视作药食兼用佳品,具有抗菌消炎、抗病毒、防治动脉硬化、降血压、降低胆固醇、降低血小板的凝集等生物活性功能。目前我国对大蒜的利用仍以食用为主,初加工产品的附加值比较低。因此开发利用我国大蒜资源,生产更多更好的高营养、高疗效、食用方便的大蒜保健食品及各种剂型的大蒜药品,有非常广阔的前景。
近年来,高血压已成为危害人类健康的一大杀手。在高血压的治疗方面,相较于药物疗法存在的副作用,天然食品中的降血压功能因子因其天然、无毒害作用的降压效果将成为今后高血压非药物治疗的重要组成部分。已有研究发现,大蒜含有ACE(血管紧张素转化酶)抑制因子,可有效降低血压。利用大蒜制备降血压物质为深度开发大蒜提供了新的途径,有利于大蒜产业向高附加值方向发展。
本课题组前期研究发现,尽管大蒜中蛋白质含量较低,但其酶解后表现出较高的ACE抑制活性;而且大蒜中含有大量的多糖,因此考虑大蒜中可能含有非多肽类的降压因子。基于上述原因,本文逐步分离大蒜粉中可能存在的具有降压活性的功能因子,以ACE抑制率为考察指标。研究发现,大蒜中的粗蛋白、粗多糖及其它水溶性物质均具有一定ACE抑制活性;对大蒜粗蛋白进行酶解处理,酶解物的ACE抑制活性显著增加;其中大蒜粉直接酶解产物具有最佳降压效果。传统酶解技术存在产物转化率低、酶利用率低、酶解时间长和产物活性低等不足。而超声辅助酶解不仅能克服上述缺陷,甚至可以提高产品的质量和产量。超声波对大蒜粉溶液进行预处理后,可以提高原料的溶解性、伸展蛋白质的螺旋结构,有利于促进酶与活性部位的结合,提高酶解效率。本文研究了聚能式及发散式两种不同形式的超声波预处理方法对大蒜粉溶液辅助酶解的影响。
在对大蒜降血压活性因子筛选的基础上,采用聚能式脉冲超声预处理方法,以大蒜粉直接酶解物为目标产物,研究了处理液初始温度、超声处理总时间、处理液pH值、单个脉冲超声工作时间及间歇时间等因素对ACE抑制率及水解度(DH)的影响。在单因素试验的基础上,采用响应面试验设计对脉冲超声辅助酶解条件进行优化。在底物浓度8%、单个脉冲超声工作时间3s、间歇时间2s的条件下,得到ACE抑制率(Y)对超声处理总时间(A)、处理液初始温度(B)及处理液pH值(C)的二次多项回归方程为:Y=-319.42100+0.92315A+5.49090B+57.79800C+0.013450AB+0.049750AC-0.15150BC-0.013445A2-0.059580B2-3.26300C2,优化得到聚能式脉冲超声辅助提取最佳条件为:超声预处理总时间72min、处理液初始温度45℃,处理液pH值8.2,此条件下酶解产物的ACE抑制率为67.78%,IC50值为6.57mg/mL;与直接酶解相比,IC50值降低了45.03%,活性增加了44.77%。
在对发散式脉冲超声辅助酶解技术的研究中,分别进行最适超声频率、单板或双板预处理方式、定频或扫频预处理方式的确定试验以及双频组合实验。得到最佳试验方法为双板工作,最佳频率组合为28/68kHz,扫频周期为20ms。选取超声预处理总时间(A)、扫频变幅(B)、单个脉冲超声工作时间(C)、脉冲超声间歇时间(D)四个因素做4因素5水平的均匀试验,以大蒜粉直接酶解物为目标产物,采用SPSS18.0软件分析得到ACE抑制率(Y)对超声处理总时间(A)、扫频变幅(B)、单个脉冲超声工作时间(C)及脉冲超声间歇时间(D)回归方程为:Y=1118.609AC/(C+D)-199.097A2C/(C+D)+86.557A3C/(C+D)+44.52,并得到最佳处理条件为:超声预处理总时间1.5h、单个脉冲超声工作时间18s、脉冲超声间歇时间3s。在扫频变幅为±2kHz的条件下,得到ACE抑制率为65.88%,IC50值为6.04mg/mL,与直接酶解相比,活性增加了40.71%,而IC50值下降了49.41%。将酶解液喷雾干燥,得到产品的IC50值为5.90mg/mL,水分为0.79%,灰分为6.21%,总糖含量为59.75%,总氮含量为15.92%,多肽含量为6.24%。将两种不同模式的超声预处理方式进行对照,发现这两种方法没有显著性差异。
研究酶水解动力学,掌握酶解过程中酶反应体系的动力特性,对制定合理的酶解工艺参数、提高水解速度和生产效率等都有较大意义。本文分别研究了聚能式超声预处理和未经超声处理两种作用方式对大蒜粉溶液酶解反应动力学的影响,并计算得到酶促反应最大速率Vmax和米氏常数Km值。通过数据分析发现,聚能式超声处理前后Vmax基本不变,而Km变小,这说明超声对酶促反应动力学的影响是通过改变酶与底物的亲和力实现的。通过对不同底物浓度(S)及不同加酶量(E)的分析,建立了超声预处理后酶促反应的动力学模型,既水解度(h)与时间(t)的关系:h=5.3099In{1+[0.3128(E/S)+0.5704]t}。对该动力学模型进行验证,发现实验数据与理论数据有较好的拟合度,平均相对误差为4.42%,说明所建立的动力学模型能较好地模拟水解体系的酶解过程。