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广州管圆线虫病是一种人兽共患食源性寄生虫病，引起该病的病原体是广州管圆线虫。此病主要流行于东南亚及太平洋沿岸国家和岛屿等地区，我国十几省都有过病例报道，在浙江和福建两省发生多次暴发流行的情况。广州管圆线虫病主要侵犯中枢神经系统，临床主要表现为嗜酸性粒细胞增多性脑炎或脑膜脑炎，如不及时治疗，则造成严重后果甚至死亡。由于该病临床表现缺乏特异的症状和体征，因而常被误诊为其它神经系统疾病，所以广州管圆线虫病的诊断是防治工作中的关键。临床诊断以患者脑脊液中查到虫体为金标准，但此检出率低，易漏诊。ELISA法检测患者特异性抗体是目前实验室中最常用于本病诊断的免疫学方法。用于ELISA诊断的抗原通常为粗抗原，但粗抗原由于特异性不理想、来源有限、费时费力等缺点使其应用受到限制。为了获得较理想的免疫学诊断结果，必须要得到特异性抗原。利用基因工程技术生产的重组抗原纯度高，成分单一，理论上是较好的解决办法。雌虫肌蛋白-1(Ac-fmp-1)位于广州管圆线虫肌细胞膜上，实验证明在感染宿主中具有较强抗原性和免疫原性，因此体外表达的Ac-fmp-1重组蛋白有望成为敏感性、特异性均理想的诊断抗原。
研究目的：①利用基因工程技术克隆Ac-fmp-1基因，运用生物信息学方法对其核苷酸和推测的氨基酸序列进行初步分析、预测以了解蛋白质的基本特征；②构建表达广州管圆线虫Ac-fmp-1蛋白的原核表达系统，优化表达条件以期获得重组蛋白的高效表达；③利用Western-blotting和ELISA分析对其抗原性进行初步研究，以期对其血清学诊断价值作出客观评价，为深入研究蛋白的诊断价值和研制新型广州管圆线虫诊断试剂盒奠定基础。
研究方法：根据发表的广州管圆线虫Ac-fmp-1基因cDNA全长序列设计特异引物，通过RT-PCR和TA克隆Ac-fmp-1基因的开放读码框全长，利用亚克隆技术定向克隆至原核表达载体pET-30a-c(+)，构建Ac-fmp-1基因原核表达载体，并转化至大肠埃希菌E.coliBL21以建立表达Ac-fmp-1重组融合蛋白的工程菌。IPTG诱导表达重组蛋白，并且优化表达条件使上述工程菌高效表达目的蛋白。亲和层析法纯化分离目的蛋白，并用Western-blotting和ELISA法对纯化分离的融合蛋白进行免疫学检测和鉴定。
研究结果：①扩增和克隆了广州管圆线虫Ac-fmp-1基因开放读码框序列，此序列与已知GenBank中Ac-fmp-1基因的CDS序列(GenBank登陆号ACU17585)的同源性为99.6％。成功地构建Ac-fmp-1基因克隆载体pMD18-Ac-fmp-1；预测蛋白分子二级结构含有一个锌指结构，并且蛋白分子有一定的亲水性和疏水性；②构建了Ac-fmp-1基因原核表达载体pET-Ac-fmp-1，获得了表达Ac-fmp-1重组融合蛋白的大肠杆菌工程菌pET-Ac-fmp-1/BL21；③在最佳表达条件(0.5mMIPTG，30℃，5h)，Ac-fmp-1基因在大肠埃希菌E.coliBL21中高效表达，应用SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析鉴定，结果显示pET-Ac-fmp-1融合蛋白相对分子量在45～66KDa之间，约为48KDa，与理论预测值47.5KDa相符，表达产物经亲和层析纯化后得到纯化的重组融合蛋白；④Western-blotting分析结果显示，重组融合蛋白与感染大鼠血清及病人血清呈现血清学反应；交叉反应分析发现重组融合蛋白除与旋毛虫感染小鼠血清有微弱的反应外，与其它几种寄生虫感染血清均无血清学反应；⑤ELISA法检测广州管圆线虫病阳性血清和其它血清，结果显示Ac-fmp-1重组蛋白有较好的敏感性和特异性，并且高于可溶性成虫抗原。
结论：①本研究在国内首次扩增和克隆了广州管圆线虫Ac-fmp-1基因开放读码框全长，并获得了体外高效表达的重组融合蛋白，Western-blotting证实重组融合蛋白具有免疫反应性；②首次研究了Ac-fmp-1重组蛋白的诊断价值，发现其具有较好的敏感性和特异性，提示其具有潜在的诊断抗原的价值，可以代替粗抗原实现经济的免疫学诊断。因此本研究为研制新型广州管圆线虫诊断试剂盒和研究广州管圆线虫分子疫苗奠定了基础。