【摘 要】
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背景:未调控生血管因子的过度表达以及心脏外脏器血管的新生大大降低了基因治疗缺血性心脏病的安全性,本课题组通过筛选出的301bp心肌特异表达troponin I（TnIc）启动子序列调控目的基因在心肌特异表达,为心血管疾病的靶向基因治疗提供一种新的策略。方法:本课题研究分2部分第一部分:筛选特异性启动子表达载体通过PCR法扩增五个分子量大小为858bp、491bp、301bp、165bp、126bp
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背景:未调控生血管因子的过度表达以及心脏外脏器血管的新生大大降低了基因治疗缺血性心脏病的安全性,本课题组通过筛选出的301bp心肌特异表达troponin I（TnIc）启动子序列调控目的基因在心肌特异表达,为心血管疾病的靶向基因治疗提供一种新的策略。方法:本课题研究分2部分第一部分:筛选特异性启动子表达载体通过PCR法扩增五个分子量大小为858bp、491bp、301bp、165bp、126bp的TnIc启动子序列,并通过电泳验证PCR扩增后序列的正确性。将五个TnIc启动子序列在骨骼肌细胞（L6）、成纤维细胞（3T3）、心肌细胞（H9C2）上进行表达特异性比较,筛选出在心肌细胞特异高表达目的基因的TnIc序列。将TnIc或巨细胞病毒（CMV）启动子调控的荧光素酶报告基因（Luc）连接至腺病毒载体,构建Ad-TnIc-Luc和Ad-CMV-Luc。离体利用荧光素酶检测体系观察转染细胞系;在体构建心肌梗死模型后立即在梗死周围区注射载体,利用活体成像仪观察Luc的表达;同时观察转染后1天、2天、3天等8个时间点包括心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌在内的各脏器荧光表达梯度。第二部分:观察构建特异性启动子携带HGF改善梗死心功能将人肝细胞生长因子（HGF）构建至先前的启动子载体,代替荧光素酶报告基因,构建Ad-TnIc-HGF和Ad-CMV-HGF。结扎大鼠冠状动脉前降支构建心梗模型,立即显微镜下梗死周围区注射构建的载体1.0×1011PFU/只,关胸正常饮食。转染后第2周、第4周和第8周利用小动物心超仪观察心功能,转染后第8周取心、肝、肺、肾组织进行免疫组化染色观察HGF表达,流式细胞仪和TUNNEL法检测心脏梗死周围区心肌细胞凋亡,马松染色观察心脏纤维化程度,利用免疫荧光观察心肌新生情况,免疫组化观察心脏干细胞数量。结果:离体实验转染Ad-TnIc-Luc后心肌细胞表达最高,与其他细胞系相比,连续五天均具有显著性差异（P<0.01）;在体实验与Ad-CMV-Luc组比较,TnIc组Luc在心脏表达特异性最强,体外荧光素酶检测示在体转染CMV组各脏器比TnIc组均高出100-1000倍（p<0.01）。TnIc组在体和离体实验模拟缺氧状态进一步提高Luc表达。心外膜注射Ad-TnIc-HGF、Ad-CMV-HGF、Ad-null或生理盐水至梗死大鼠心肌梗死周围,免疫组化法显示TnIc组能特异调控HGF在心脏表达。与生理盐水组和空载体组相比,CMV组和TnIc组能显著改善心功能。Ad-CMV-HGF组射血分数上升了26.0±1.4%,并能持续到第8周,心梗+Ad-TnIc-HGF则未见到射血分数的明显提高。结论:筛选出的301bp的腺病毒携带的TnIc启动子能够特异性调控目的基因Luc在心脏的表达,缺氧环境能进一步提高目的基因表达。但如何提高301bpTnIc启动子序列调控下的目的基因表达效率将是下一步研究重点。
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