研究背景和目的:喉癌是指原发部位在喉部的恶性肿瘤,病理类型主要为喉鳞状细胞癌,常好发于中老年男性,我国东北地区是喉癌的高发区域,手术是其治疗的主要手段。肿瘤的形成是正常细胞在多种致癌因素作用下,在基因水平上失去正常的调控而导致的,包括遗传学和表观遗传学改变。表观遗传学（epigenetics）是相对于遗传学概念而言,在不改变DNA双链序列的前提下,添加相应的修饰基团调控靶基因的表达,包括DNA甲基化、染色质组蛋白的修饰和非编码RNA调控等。DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要调控机制,参与机体的重要生理作用,包括肿瘤的发生发展。研究表明,DNA甲基化与喉癌之间关系密切,P21和P53是重要的细胞周期调控基因,但其DNA甲基化作用在喉癌发生发展中的作用仍不清楚。本课题以P21和P53基因为研究对象,从喉癌组织标本入手,详细研究DNA甲基化对P21和P53基因表达调控的作用机制,以期为喉癌在临床上的基因分子水平的治疗提供新的靶点。研究材料和方法:1.研究材料标本来源于2014年6月-2015年5月在上海市第一人民医院住院的喉癌患者,患者在行喉癌手术前没有经过放疗或化疗治疗,术后组织标本病理诊断均为喉鳞状细胞癌,均为原发性肿瘤。总计46例喉癌患者（男性44例,女性2例）,收集其配对的癌组织和癌旁组织,术中快速将新鲜组织标本装在2 ml冻存管,标记后快速放进液氮罐,在-80℃冰箱保存。喉癌细胞系Hep-2购置中国科学院上海细胞库。2.研究方法2.1喉癌组织及癌旁组织研究P21和P53基因DNA甲基化检测采用常规methylation specific PCR（MSP）法及 bisulfite sequencing PCR（BSP）法,分析 P21、P53 基因启动子区 CpG 岛每个位点甲基化状态。2.2喉癌细胞系研究给予去甲基化药物5-azacytidine干预Hep-2细胞系,进行相关检测:用MTT法检测5-azacytidine及作用时间对喉癌细胞系Hep-2增殖的影响。用TUNEL法检测5-azacytidine及作用时间对喉癌细胞系Hep-2凋亡的影响。采用RT-PCR法检测干预前后P21基因mRNA的差异。采用MSP法检测干预前后P21启动子区CpG岛甲基化状态变化。研究结果:1.喉癌组织及癌旁组织的P21和P53基因DNA甲基化修饰检测MSP法检测46例喉癌组织中,21例P21基因启动子区CpG岛发生甲基化,发生率45.7%;46例癌旁组织中,5例P21基因发生甲基化,发生率10.9%;P21基因喉癌组织甲基化发生率与癌旁组织比较有显著差异（p<0.05）。46例喉癌组织,3例P53基因基因启动子区CpG岛发生甲基化,发生率0.065%;46例癌旁组织,2例P53基因发生甲基化,发生率0.043%;喉癌组织P53基因甲基化发生率与癌旁组织比较无显著差异（p>0.05）。BSP法检测46例喉癌组织中表现为P21基因CpG位点完全甲基化或部分甲基化,而癌旁组织中CpG位点大部分非甲基化,少数甲基化（喉癌组织vs癌旁组织:0.4675±0.03245 vs0.1346±0.02785）。P53基因CpG位点在喉癌组织和癌旁组织中主要表现为非甲基化修饰（喉癌组织vs癌旁组织:0.1135±0.03526 vs 0.1024 ± 0.02965）。2.对喉癌细胞系P21基因DNA甲基化修饰检测MTT法 5-azacytidine对Hep-2细胞增殖的抑制作用随着时间的延长逐渐增加,呈时间依赖性。TUNEL法在一定时间内,随着时间的延长,细胞增殖受到不同程度的抑制。经5-azacytidine干预后,随着天数的增加,细胞凋亡率增加。半定量RT-PCR Hep-2细胞系在5-azacytidine干预后P21基因被激活,表达明显增高。MSP法喉癌细胞系Hep-2中P21基因甲基化程度为43.13%±0.79%,经5-azacytidine干预后,甲基化程度明显下降,甚至表现为无甲基化。。结论:1.喉癌组织和喉癌细胞系Hep-2中存在P21基因启动子CpG岛高甲基化,是喉癌区别于正常组织的分子事件。P53基因在喉癌组织和喉癌细胞系Hep-2中低甲基化,其基因的失活可能通过基因突变等其他形式来发生。2.去甲基化药物5-azacytidine可以通过诱导P21基因启动子CpG岛去甲基化修饰,改变肿瘤细胞细胞周期基因的调控,促进肿瘤细胞凋亡。3.P21基因启动子CpG岛高甲基化有可能成为喉癌诊断的肿瘤标志物之一。