背景:肺癌因其全球性的高发病率（220.6万例,11.4%）及高死亡率（179.6万例,18%）严重威胁着人类健康,是对人类危害最大的癌症之一[1]。寻求提高肺癌疗效的新的治疗方法始终是研究热点,目前治疗肺癌的主要方式包括手术治疗、化疗、放疗、靶向药物治疗和免疫治疗。免疫治疗包括主动免疫治疗和被动免疫治疗两个方面,目前临床上较常应用的免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors,ICIs）治疗属于作用于免疫系统本身的主动免疫治疗,有数据显示在ICIs应用于临床后,大约有30%的患者从中获益[2]。单克隆抗体治疗与过继细胞疗法属于作用于肿瘤的被动免疫治疗。近年来,越来越多的靶向治疗被批准用于肺腺癌（Lung Adenocarcinoma,LUAD）的治疗[3-6];然而针对肺鳞癌（Lung Squamous Cell Carcinoma,LUSC）,并没有基因型匹配的靶向治疗[7]。此外由于过继细胞疗法因特异性和靶向性等问题没有达到理想的临床疗效,在临床中开展缓慢,所以通过提高过继免疫疗法对LUSC治疗的靶向性从而提高LUSC对治疗的敏感性是临床上亟待解决的问题之一。抗肿瘤免疫疗法以细胞免疫为核心[8],细胞免疫多亲近于肿瘤中浸润淋巴细胞较多的“热肿瘤”,但即便在“热肿瘤”中,大约也只有10%的肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltration Lymphocytes,TILs）有识别肿瘤细胞的能力,其他未能识别肿瘤细胞的肿瘤浸润淋巴细胞属于旁观细胞。TILs不仅能识别肿瘤细胞还能发挥杀伤肿瘤的功能,此外,TILs还可介导肿瘤免疫微环境,致使机体的抗肿瘤免疫原性减弱,使得肿瘤细胞发生免疫逃逸。在抗肿瘤的细胞免疫过程中,只有当抗原呈递细胞（Antigen Presenting Cell,APC）通过主要组织相容复合体-I类分子（Major Histocompatibility Complex-I,MHC-I）呈递肿瘤相关抗原于CD8+T细胞,并提供共刺激和细胞因子信号,才能激活特异性免疫应答,从而实现对肿瘤细胞的杀伤。因此,提高肿瘤的免疫原性,是提高对肿瘤杀伤力的核心问题之一。树突状细胞（Dendritic Cell,DC）是体内摄取、加工、呈递抗原的最重要的APC,它呈递抗原的能力最强,近年来研究发现,经修饰后的DC可增强免疫原性,进而通过有效识别活化细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）特异性靶向杀伤肿瘤细胞。目前尽管研究人员对于DC的作用和功能的认识取得较大进展,但关于特异性抗原负载DC提高抗肿瘤免疫的靶向性仍有待于深入研究。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3,GPC3）是一种锚定在细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparan Sulfate Proteoglycan,HSPG）。研究发现,GPC3在包括肺癌在内的肿瘤组织中普遍过表达,而在正常组织中几乎不表达[9,10]。GPC3在LUSC的表达率约为45%～58%[9,11],在LUAD的表达率约为3～10%[9,11]。肺癌中许多值得关注的肿瘤抗原,包括黑色素瘤相关抗原A3（Melanoma-associated Antigen A3,MAGE-A3）、黑色素瘤相关抗原A4（Melanoma-associated Antigen A4,MAGE-A4）和纽约食管鳞状上皮癌抗原1（New York Esophageal Squamous Cell Carcinoma 1,NY-ESO-1）,在鳞癌中比在非鳞癌中表达更为频繁[12-15]。此外,与非鳞癌相比,CD8+淋巴细胞更广泛地浸润LUSC[16]。LUSC的基因组分析发现,许多样本显示人类白细胞抗原-I类分子（Human Leukocyte Antigen-I,HLA-I）基因突变失活,由此可能导致免疫功能丧失和肿瘤抗原表达减少,进而发生免疫逃逸[17]。正是因为GPC3在正常人组织中几乎不表达,在LUAD中低表达及LUSC中高表达的情况,我们认为GPC3有望作为LUSC的肿瘤相关抗原在免疫治疗中发挥作用,成为LUSC合理的免疫治疗靶点。目的:我们拟通过生信分析GPC3在LUSC的差异表达情况及GPC3与LUSC临床特征的关系;在细胞学水平上分析GPC3对LUSC恶性生物学行为的影响及机制;体外实验检测构建的HLA-A2限制性GPC3免疫原性表位肽致敏DC诱导特异性CTL对LUSC的杀伤作用。以期证明GPC3通过调节细胞周期相关蛋白参与调节信号通路从而影响LUSC,以及GPC3免疫原性表位肽致敏DC诱导CTL产生特异性抗肿瘤细胞免疫应答反应。为克服MHC介导的免疫逃逸机制、提高免疫细胞对LUSC的杀伤效果、探索LUSC免疫治疗的新靶点提供依据。研究方法:1、采用生物信息学方法分析GPC3在LUSC中的差异表达情况。2、通过免疫组化染色方法验证GPC3在人LUSC组织中的表达,并进行GPC3表达与LUSC的预后分析。3、构建慢病毒载体介导GPC3沉默和过表达的人LUSC细胞系,通过q RT-PCR,Western Blotting和免疫荧光方法进行验证。4、CCK-8法和克隆形成实验检测GPC3对LUSC细胞增殖的影响。5、Annexin-V/PI双染法流式细胞仪检测GPC3对细胞凋亡的影响。6、PI单染法流式细胞仪检测GPC3对LUSC细胞周期的影响。7、细胞划痕实验检测GPC3对LUSC细胞迁移的影响。8、Transwell实验检测GPC3对LUSC细胞迁移和侵袭的影响。9、Western blotting法检测GPC3变化对PI3K/Akt信号通路关键蛋白的影响。10、通过生物信息学数据库预测HLA-A2限制性GPC3免疫原性表位肽并合成。11、体外分离、诱导成熟DC及鉴定。12、ELISA方法检测DC细胞因子分泌水平。13、体外诱导CTL及分选。14、CTL对靶细胞最佳杀伤比例确定及对人LUSC细胞的细胞毒活性分析。15、每组实验重复3次,采用SPSS 23.0统计软件,根据样本资料进行t检验、卡方检验或秩和检验分析,结果以均数±标准差（`x±s）表示,P＜0.05认为有统计学意义。结果:1、生物信息学分析筛选出在正常组织和LUSC组织中表达存在差异的基因GPC3。差异基因进行富集分析提示GPC3与LUSC的细胞增殖相关。STRING数据库构建PPI网络,发现GPC3与IHH和WNT2具有直接互作关系。将数据库获取的GPC3表达值与LUSC临床病理特征进行统计分析,发现TCGA数据库中提取的GPC3表达值数据与LUSC临床病理特征无明显相关性。KM-plotter生存分析结果提示,GPC3、IHH和WNT2与LUSC预后显著相关,P＜0.05。2、对收集的人LUSC组织及癌旁组织标本进行GPC3免疫组化实验结果显示,GPC3在癌旁正常组织中染色阳性率为5.8%（20/342）,在LUSC组织阳性染色率为50.6%（173/342）。GPC3在转移淋巴结中阳性染色率为12.7%（20/157）,在正常淋巴结染色均为阴性（0/342）。临床病理特征统计学结果显示,在LUSC患者中,GPC3阳性表达与是否吸烟,临床分期和转移淋巴结GPC3阳性染色具有相关性（P＜0.05）,与生存时间呈负相关（P＜0.05）。3、Western Blotting,q RT-PCR检测结果显示,GPC3在人LUSC细胞系中表达升高。免疫荧光方法证明GPC3为细胞膜表达。在人LUSC细胞系中观察到,GPC3基因沉默可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡（P＜0.05）;GPC3基因过表达可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡（P＜0.05）;GPC3基因沉默可引起细胞发生G1期阻滞,S期比例减少（P＜0.05）;GPC3基因过表达可引起S期比例增加（P＜0.05）;GPC3基因沉默可使细胞迁移和侵袭能力降低（P＜0.05）;GPC3基因过表达可使细胞迁移和侵袭能力增加（P＜0.05）。BALB/c小鼠皮下荷瘤动物模型体内实验证实GPC3可促进LUSC肿瘤的形成。GPC3可能通过调节PI3K/Akt信号通路影响细胞周期,从而参与LUSC的恶性生物学行为。4、我们预测并合成HLA-A2限制性自然加工的3个GPC3免疫原性表位肽,序列分别为169-177 ELFDSLFPV,522-530 FLAELAYDL和102-110 FLIIQNAAV。流式细胞仪检测证实经体外诱导分化成熟的DC可高表达HLA-DR、CD11c、CD80/86和CD83分子。GPC3免疫原性表位肽加载与否并不影响TNF-α对成熟DC的诱导。ELISA实验证实,经GPC3免疫原性表位肽负载的成熟DC分泌细胞因子IL-12和IL-2增多,IL-10和IL-6减少（P＜0.05）;ELISA实验证实活化后的CTL作用于人LUSC后分泌IFN-γ增多,并且伴随效靶比增加CTL分泌IFN-γ水平增加。流式细胞仪检测细胞凋亡和克隆形成实验检测CTL对人LUSC的杀伤情况,结果显示,经预测合成HLA-A2限制性GPC3的3个免疫原性表位肽负载DC活化的CTL对LUSC细胞的杀伤效果中,序列为522-530 FLAELAYDL,102-110 FLIIQNAAV的免疫原性表位肽杀伤力最强,且最佳杀伤效靶比为80:1。结论:在LUSC中,GPC3阳性表达与与生存时间呈负相关,与吸烟情况,临床分期和转移淋巴结GPC3阳性表达情况具有相关性。GPC3可能通过调节Cyclin A、E2F1和c-Myc参与PI3K/Akt信号通路影响细胞周期,从而促进LUSC的发生发展。HLA-A2限制性GPC3免疫原性表位肽修饰DC诱导特异性CTL可增强对LUSC的靶向杀伤。