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第一部分实时定量RT-PCR检测乳腺珠蛋白mRNA方法学建立目的建立SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR检测hMAM基因的方法。方法将hMAM基因RT-PCR扩增片段克隆到载体pGEM-T后，经测序鉴定正确后，进行纯化和定量及系列稀释，应用SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR检测hMAM，建立标准曲线，熔解曲线分析产物的特异性。结果该法检测的最低拷贝数为2，线性范围为2～2×10~6拷贝，相关系数r为-0.99，检测2×10~4copies／μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.50％和3.26％，熔解曲线分析显示单一的峰。结论实时定量RT-PCR方法检测hMAM基因，具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点，可作为进一步研究hMAM的方法。第二部分多重标志物(Survivin、hTERT和hMAM)实时定量RT-PCR检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞目的建立一种特异可靠的方法检测乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)，并且探讨乳腺癌患者外周血分子标志物(Survivin、hTERT和hMAM)的表达与临床病理特征的相关性。方法收集94例乳腺癌患者、35例良性乳腺肿瘤患者、25例其它实体瘤患者以及40例健康对照者的外周血。通过实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测外周血存活素(Survivin)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和人乳腺珠蛋白(hMAM)的mRNA表达。结果Survivin、hTERT和hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血表达的阳性率分别为36.2％、59.6％和33.0％，Survivin，hTERT能在除了乳腺癌患者以外其它实体瘤患者中检测出，但是hMAM仅仅能在乳腺癌外周血中检测出。联合三种标志物并联试验检测阳性率为70.2％，与单一标志物检测相比较，三种标志物联合应用比单一标志物检测阳性率显著增高，采用串联试验方法评价，检测的特异性为100％。三种标志物的表达水平与患者的TNM期及淋巴结转移有关。结论检测乳腺癌患者外周血中Survivin，hTERT和hMAM mRNA的表达，是一种可行的方法。联合三种标志物的并联试验，增加检测的灵敏度。这种分析方法提供了一种简单的、非损伤性的早期检测乳腺癌患者微转移的辅助方法。第三部分实时定量RT-PCR检测大肠癌患者外周血Survivin、CK20和CEA mRNA的表达目的建立一种敏感、有效的方法检测大肠癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)，提高检测大肠癌患者外周血CTCs检测的灵敏度，并且探讨大肠癌患者外周血中Survivin、CK20和CEA mRNA的表达与临床病理特征的相关性。方法收集156例大肠癌患者、40例良性大肠疾病患者、45例其它实体瘤患者和40例健康对照者的外周血。首先采取联合阴、阳性免疫磁珠方法来富集肿瘤细胞，然后通过实时定量RT-PCR(qRT-PCR)方法检测存活素(Survivin)、细胞角蛋白20(CK20)和癌胚抗原(CEA)mRNA的表达。结果Survivin、CK20、CEA mRNA在大肠癌患者外周血表达的阳性率分别为57.7％、47.4％和39.1％，联合三种标志物检测阳性率为60.9％。在大肠癌患者中，三种标志物的表达显著高于正常对照和良性疾病对照组，Survivin和CK20 mRNA在大肠癌与其它实体瘤患者外周血表达没有显著性差异，但是CEA mRNA在大肠癌外周血中表达显著高于其它实体瘤患者。三种标志物的表达与患者的Duke分期和淋巴结转移显著相关。结论联合阴、阳性免疫磁珠富集肿瘤细胞后，采用qRT-PCR方法检测大肠癌外周血的Survivin、CK20和CEA mRNA表达是一种非损伤性、敏感的检测大肠癌CTCs方法，联合三种标志物能够增加检测的灵敏度。第四部分实时荧光定量端粒重复扩增法检测大肠癌患者单个核细胞端粒酶基因表达目的建立实时荧光定量端粒重复扩增法(RTQ-TRAP)检测端粒酶基因表达的方法，探讨检测大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)端粒酶基因表达在诊断大肠癌微转移的应用。方法用RTQ-TRAP检测71例大肠癌和20例良性大肠疾病患者，以及25名健康人PBMC端粒酶基因表达，同时检测大肠癌患者血浆癌胚抗原(CEA)含量。结果71例大肠癌患者中，50例端粒酶基因表达阳性，阳性率70.4％，20例良性大肠疾病阳性率为5.0％(1／20)，大肠癌患者与良性大肠疾病和健康对照组PBMC端粒酶基因表达有显著性差异(χ~2=24.521，P＜0.001)。大肠癌患者在不同性别(χ~2=0.114，P=0.736)、年龄(χ~2=0.113，P=0.735)、肿瘤部位(χ~2=1.523，P=0.677)、Dukes分期(χ~2=2.282，P=0.320)间端粒酶基因表达差异无统计学意义。71例大肠癌患者PBMC端粒酶基因表达阳性率与CEA阳性率(63.4％)比较，差异无统计学意义(χ~2=2.286，P=0.125)。结论RTQ-TRAP是一种快速、准确、定量检测端粒酶基因表达的方法，大肠癌患者PBMC端粒酶活性是一项有效的辅助诊断大肠癌微转移的分子标志。