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目的铁死亡是一种铁离子依赖的新型细胞死亡方式,与缺血再灌注损伤、癌症、神经退行性疾病等多种疾病相关,靶向铁死亡可以治疗铁过载相关疾病。本研究利用（1S,3R）RAS-selective lethal 3（RSL3）诱导HT-1080细胞发生铁死亡,以及ferrostatin-1（Fer-1）抑制细胞铁死亡,探究RSL3及Fer-1对HT-1080细胞活性及形态学影响,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF MS）对细胞内外液进行非靶向代谢组学检测,探索铁死亡相关代谢特征及其代谢标志物,为RSL3诱导的细胞铁死亡相关研究提供代谢组学依据。方法以HT-1080细胞为研究对象,设置时间梯度（3、6、12 h）,用RSL3诱导细胞发生铁死亡,Fer-1抑制细胞铁死亡。实验分三组,分别为铁死亡诱导组（RSL3组）、铁死亡抑制组（RSL3+Fer-1组）、溶剂对照组（DMSO组）。使用不同浓度的RSL3混悬液刺激HT-1080细胞,0.5和1μM的Fer-1抑制细胞死亡。CCK-8法检测各组细胞活性,还原性谷胱甘肽（GSH）试剂盒法测定不同时间下各组细胞内产生的GSH水平。使用光学显微镜观察不同时间RSL3及Fer-1作用下的细胞形态学变化。收集细胞内液和细胞外液,采用UPLC-QTOF MS进行代谢组学分析。代谢组学数据采用Metabo Analyst 5.0在线软件系统分析。采用Metabo Analyst 5.0统计分析模块进行主成分分析、t检验、偏最小二乘判别分析、火山图及热图分析;并根据P值、变化倍数、重要变量投影值鉴定差异代谢物。使用Metabo Analyst 5.0功能分析（MS peak to Pathways）模块进行代谢通路分析。结果1.RSL3和Fer-1对HT-1080细胞活性的影响1μM RSL3作用于HT-1080细胞,3、6、12 h细胞存活率分别为89.64%、68.05%、30.39%。同时加入0.5μM Fer-1,细胞存活率分别为100.37%、85.35%、71.08%。2.RSL3及Fer-1对HT-1080细胞GSH水平的影响DMSO对照组,RSL3组,RSL3+Fer-1组,在3、6、12h细胞内GSH水平差异均无统计学意义（P>0.05）。3.RSL3及Fer-1作用后HT-1080细胞形态学变化倒置光学显微镜下可观察到RSL3作用12h能够引起肉眼可见的细胞死亡,添加Fer-1后可以明显抑制细胞死亡,但不能观察到细胞内部结构的变化。3、6h,没有明显的细胞死亡,但是细胞内外代谢物已经发生了显著变化。4.UPLC-QTOF MS结果主成分分析图中质量控制样本聚集在一起,表明方法重复性好,模型稳定。不同时间各模式中,正交偏最小二乘判别分析模型构建良好,RSL3组vs DMSO组,RSL3+Fer-1组vs RSL3组聚类明显,表明各组间存在代谢差异。火山图显示代谢物的整体变化趋势,热图显示差异代谢物含量的变化。差异代谢物:细胞内液正离子模式,RSL3组vs DMSO组,共鉴定出152个差异代谢物,其中135个代谢物下调,17个代谢物上调;RSL3+Fer-1组vs RSL3组,有64个差异代谢物与RSL3组vs DMSO组结果一致。细胞内液负离子模式,RSL3组vs DMSO组中共鉴定出87个差异代谢物,其中70个代谢物下调,17个代谢物上调;RSL3+Fer-1组vs RSL3组,共鉴定出70个代谢物在RSL3组vs DMSO组也有意义。细胞外液正离子模式在RSL3组vs DMSO组中,共鉴定出103个差异代谢物,其中102个代谢物下调,1个代谢物上调;在RSL3+Fer-1组vs RSL3组,有56个代谢物在RSL3组vs DMSO组也具有差异。RSL3+Fer-1组vs RSL3组的差异代谢物与RSL3组vs DMSO组变化趋势相反。三种模式下鉴定出与铁死亡相关的差异代谢物主要是磷脂类代谢物,包括磷脂酰乙醇胺化合物,如PE-NMe（18:3（9Z,12Z,15Z）/20:0）,溶血磷脂酰乙醇胺化合物如Lyso PE(0:0/16:1（9Z）,溶血磷脂酰胆碱如Lyso PC（20:1（11Z））,磷脂酰丝氨酸（PS）,磷脂酰甘油（PG）等。谷胱甘肽、S-乳糖基谷胱甘肽,NADH,NADPH等代谢物也有重要意义。差异代谢通路:在细胞内液RSL3组vs DMSO组中,角鲨烯和胆固醇的生物合成,脂肪酸代谢,脂肪酸从头生物合成,脂肪酸活化,糖脂代谢,饱和脂肪酸β-氧化,甘油磷脂代谢等代谢通路具有统计学意义（P<0.05）。细胞内液RSL3+Fer-1组vs RSL3组,卟啉代谢,天门冬氨酸和天冬酰胺代谢,饱和脂肪酸β-氧化,谷胱甘肽代谢,嘧啶代谢,甘油磷脂代谢等代谢通路具有统计学意义（P<0.05）。细胞外液样品代谢通路分析中,仅肉碱转运在RSL3组vs DMSO中具有统计学意义（P<0.05）。结论1.RSL3作用于HT-1080引起了代谢紊乱,Fer-1能够逆转RSL3引起的代谢物变化。细胞内液有239个差异代谢物,其中205个代谢物下调,34个代谢物上调。细胞外液有103个差异代谢物,除1个上调外,其他全部下调。磷脂类化合物、谷胱甘肽、S-乳糖基谷胱甘肽、NADH、NADPH等代谢物是与铁死亡明确相关的重要代谢物。2.角鲨烯和胆固醇的生物合成、谷胱甘肽代谢、饱和脂肪酸β-氧化以及脂肪酸代谢等通路可能是铁死亡发生过程中的具有意义的代谢通路。