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目的:1.提取人脂肪间充质干细胞,鉴定脂肪间充质干细胞,诱导脂肪间充质干细胞多向分化2.提取脂肪间充质干细胞来源的外泌体,鉴定脂肪间充质干细胞来源的外泌体3.观察脂肪间充质干细胞来源的外泌体对小鼠创面修复的影响。方法:1.收集正常成年女性行吸脂术后腹部浅层皮下脂肪,用酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞进行原代培养,用细胞贴壁法纯化,胰酶消化传代。选取第3代细胞,进行流式细胞学鉴定;诱导第3代细胞向脂肪细胞分化,第14天油红O染色,观察分化情况;诱导第3代细胞向成骨细胞分化,第9天碱性磷酸酶染色,观察成骨化早期标志,第21天茜素红S染色,观察I型胶原钙化情况。2.收集第3-6代脂肪间充质干细胞的细胞培养液,差速离心法提取外泌体,BCA法测定蛋白浓度,透射电镜观察外泌体形态,粒度仪测外泌体直径分布,免疫磁珠法和流式细胞学相结合的方式检测外泌体及其来源细胞表面标志物。3.制备小鼠背部全层皮肤创面模型30只,随机分为EXO组、PBS组、空白组3组。EXO组经鼠尾静脉注射200uLEXO悬液,PBS组经鼠尾静脉注射200uLPBS,空白组不予处理。分别于第1、3、7、14天观察创面愈合情况,并统计分析各时间点残余创面面积,第7、14天处死小鼠,取组织行HE、Masson染色,观察纤维生成及胶原表达情况。结果:1.脂肪间充质干细胞经多次传代后,形态为长梭形,形似成纤维细胞,生长旺盛时呈旋涡状排列。流式细胞学检测显示CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,CD34、CD45为阴性表达。成骨诱导第9天时碱性磷酸酶染色呈蓝紫色,第21天时,细胞层次不清,排列紊乱,茜素红S染色可见红色矿化钙结节。成脂诱导14天后细胞胞浆内出现大量的透光性良好的大小不等的空泡,油红O染色呈橘红色。2.透射电镜显示外泌体形态为杯状,直径为81.225±22.226nm,有膜结构。蛋白浓度约为1.5mg/mL,直径分布集中于70-100nm,流式细胞学显示CD9、CD29、CD44、CD63、CD90、CD105为阳性表达,CD34、CD45为阴性表达。3.创面大体观察显示,第7天时,EXO组与另两组相比,残余创面面积稍小;第14天时,EXO与另两组相比,愈合速率明显加快,残余创面面积明显减少。HE染色显示,第7天,EXO组与另外两组相比,炎性细胞浸润稍少,纤维生成稍多,但均排列紊乱,上皮化不明显;第14天,3组炎性细胞浸润均明显减少,纤维组织排列,EXO组比PBS组、空白组更整齐,上皮化EXO组也更加明显。Masson染色显示,第7天,EXO组胶原表达比另两组稍高,虽均排列紊乱,但较另两组好;第14天,3组胶原表达都有所增高,EXO组增高尤为明显,排列也更加整齐。结论:1.脂肪间充质干细胞能通过较为简便的方法大量提取,并能通过流式细胞学与诱导多向分化成功鉴定。2.脂肪间充质干细胞来源的外泌体能通过超速离心法顺利提取,并通过透射电子显微镜、免疫磁珠法和流式细胞学方法相结合的方法成功鉴定。3.脂肪间充干细胞来源的外泌体经鼠尾静脉注射能够促进小鼠背部创面愈合。