目的:缺血性心脏病（IHD）已然是全球导致死亡的首要原因。2017年全球疾病负担（GBD）统计表明,IHD影响了全球约1.26亿人,约占世界总人口的1.72%。其中,IHD导致死亡的约有900万人,这使得IHD成为全球导致死亡的主要原因;同时,基于构建的预测模型得到的患病率数据表明,到2030年,IHD的患病率可能会增加到每1,000,000人中1,845人以上。在中国,IHD同样是导致死亡的首要原因。研究结果显示,IHD是2017年中国全国范围内死亡和DALYs的主要原因,经过年龄调整的IHD也是YLL最主要病因。IHD是由冠状动脉循环不足而引起的心肌缺血、缺氧性心脏病。在特定因素影响下,冠脉内皮会产生损伤,在一系列过程之后,动脉内膜变硬、变僵直,并有钙盐、脂肪脂质和异常的炎症细胞沉积,从而形成斑块;这些斑块和斑块破溃后形成的血栓会阻塞冠脉腔,最终使得缺血与缺氧在心肌中产生。研究表明,其他诸如炎症反应、微血管功能障碍、内皮功能障碍、心理应激（神经系统）和血管生成等也能够促进心肌缺血。然而,不管由什么原因引起,IHD的病理特征都是冠状动脉血流量降低从而导致的心肌供血、供氧不足。而心肌的供血供氧不足则会导致许多心脏方面的疾病发生,比如心肌梗死等。也就是说,IHD中的缺血缺氧诱导的心肌细胞损伤最终都会导致正常的心脏功能受损,从而给患者带来极大的危害甚至是生命危险。缺氧诱导因子1（HIF-1）是介导细胞适应缺氧环境的主要转录因子,主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成。HIF-1主要是从以下三个方面使细胞适应新的低氧环境:下调耗氧过程,上调厌氧过程以及恢复正常的氧气输送。HIF-1活性的激活实际上是由环境氧气浓度变化引起的HIF-1α的m RNA以及蛋白水平的波动实现的。HIF-1α的心肌保护作用在缺血性心脏的应激反应的早期阶段很重要。很多研究都表明HIF-1α在心肌缺氧时具有保护心肌细胞、减少缺氧诱导的心肌细胞损伤的作用。Septin4基因主要编码两种蛋白,Septin4＿i1（H5/PNUTL2）和Septin4＿i2（ARTS）。Septin4＿i2（ARTS）是一种肿瘤抑制蛋白,它位于线粒体外膜。一般认为,ARTS是在与XIAP发生拮抗作用后导致凋亡发生。也有研究发现Septin4＿i1具有促进人肝癌细胞细胞凋亡的作用,并且有其他研究发现这有可能是经过PI3K/Akt通路实现。近年来,还有学者发现在一些肿瘤细胞中,BAX和Bcl-2也是Septin4发挥促凋亡作用的蛋白底物。但是,Septin4在缺氧诱导的心肌细胞损伤甚至凋亡与坏死中的作用从来没有被研究过;另外,也没有研究探讨过心肌细胞中是否存在一种全新的Septin4底物。本研究旨在探讨Septin4在缺氧诱导的心肌细胞中的表达水平及其参与缺氧诱导的心肌细胞损伤的作用与机制。方法:1.探讨缺氧刺激对Septin4表达水平的影响。我们使用缺氧刺激作为构建心肌细胞损伤模型的刺激因素。首先我们将心肌细胞分为四组,分别对其进行缺氧0h、6h、12h和24h处理。然后,我们使用CCK8和FITC-PI试剂盒分别检测细胞活力和凋亡率。最后,通过western blot实验（免疫印迹实验）,我们检测Septin4蛋白表达量、凋亡相关蛋白cleaved caspase3蛋白表达量。2.探讨过表达Septin4对缺氧诱导的心肌细胞损伤的影响。首先我们将细胞分为八组:空载+缺氧0h组,空载+缺氧6h组,空载+缺氧12h组,空载+缺氧24h组,Flag-Septin4+缺氧0h组,Flag-Septin4+缺氧6h组,Flag-Septin4+缺氧12h组,Flag-Septin4+缺氧24h组;然后分别使用CCK8试剂盒与FITC-PI试剂盒检测细胞活性与凋亡率。接着,我们将细胞分为四组:空载组,空载+缺氧24h组,Flag-Septin4组,Flag-Septin4+缺氧24h组;然后,通过免疫印迹实验,我们检测Septin4蛋白表达量、cleaved caspase3蛋白表达量。3.探讨敲减Septin4对缺氧诱导的心肌细胞损伤的影响。首先我们将细胞分为八组:si-con+缺氧0h组,si-con+缺氧6h组,si-con+缺氧12h组,si-con+缺氧24h组,si-Septin4+缺氧0h组,si-Septin4+缺氧6h组,si-Septin4+缺氧12h组,si-Septin4+缺氧24h组;然后分别使用CCK8试剂盒与FITC-PI试剂盒检测细胞活性与凋亡率。接着,我们将细胞分为四组:si-con,si-con+缺氧24h组,si-Septin4组,si-Septin4+缺氧24h组;然后,通过免疫印迹实验,我们检测Septin4蛋白表达量、cleaved caspase3蛋白表达量。4.探讨Septin4是否通过降低HIF-1α表达参与缺氧诱导的心肌细胞损伤。首先我们将细胞分为六组:sh-con组,sh-con+缺氧24h组,sh-Septin4组,sh-Septin4+缺氧24h组,sh-Septin4+Flag-Septin4组,sh-Septin4+Flag-Septin4+缺氧24h组;然后,使用CCK8和FITC-PI试剂盒分别检测细胞活力和凋亡率。最后,通过免疫印迹实验,我们检测Septin4蛋白表达量、cleaved caspase3蛋白表达量。5.探讨Septin4与HIF-1α在正常及缺氧条件下的结合情况及具体的结合部位。首先,我们将蛋白样品按照所加抗体分为两组:Septin4抗体（或HIF-1α抗体）组和Ig G组,然后用免疫共沉淀实验检测HIF-1α（或Septin4）的表达量。接着,我们将蛋白样品分为三组:Septin4抗体（或HIF-1α抗体）组,Septin4抗体+缺氧24h（或HIF-1α抗体+缺氧24h）组和Ig G组,然后用免疫共沉淀实验检测HIF-1α（或Septin4）的表达量。最后,我们将蛋白样品分为六组:Flag-Septin4组、截短序列1组、截短序列2组、截短序列3组、截短序列4组、空载组,其中每组均加入等量Flag beads,然后用免疫共沉淀实验检测HIF-1α的表达量。6.探讨过表达Septin4与使用CHX或过表达Septin4与使用MG132对HIF-1α表达量的影响。首先我们将细胞分为四组,分别转染0μg、1μg、3μg、5μg的Flag-Septin4质粒,然后用western blot检测HIF-1α表达量。接着,我们还是将细胞分为四组,分别转染si-con、si-Septin4 1、si-Septin4 2、si-Septin4 3片段,然后用western blot检测HIF-1α表达量。再接下来,我们将细胞分为六组:空载+CHX 0h、空载+CHX 4h、空载+CHX 8h、Flag-Septin4+CHX 0h、Flag-Septin4+CHX 4h、Flag-Septin4+CHX 8h,然后用western blot检测HIF-1α表达量。最后,我们还是将细胞分为六组:空载+MG132 0h、空载+MG132 4h、空载+MG132 8h、Flag-Septin4+MG132 0h、Flag-Septin4+MG132 4h、Flag-Septin4+MG132 8h,然后用western blot检测HIF-1α表达量。7.探讨Septin4对HIF-1α泛素化的影响。首先我们将蛋白样品按照所加抗体分为三组:HIF-1α抗体（或Septin4抗体）组,HIF-1α抗体+MG132（或Septin4抗体+MG132 8h）组和Ig G组,然后用免疫共沉淀实验检测Septin4（或HIF-1α）蛋白表达。接着,我们将细胞分为三组:空载+HA-UB+MG132组,Flag-Septin4+HA-UB+MG132组和纯对照组或者是:si-con+HA-UB+MG132组,si-Septin4+HA-UB+MG132组和纯对照组,然后用免疫共沉淀实验检测HA表达。8.探讨Septin4影响HIF-1α降解的具体中间分子。首先,我们将细胞分为六组:空载组、空载+缺氧24h组、Flag-Septin4组、Flag-Septin4+缺氧24h组、Flag-Septin4+BAY85-3934组、Flag-Septin4+BAY85-3934+缺氧24h组,然后用western blot实验检测HIF-1α表达。接着,我们将细胞分为三组:空载+HIF-1α抗体组、Flag-Septin4+HIF-1α抗体组和空载+Ig G组或者si-con+VHL抗体组、si-Septin4+VHL抗体组和si-con+Ig G组,然后用免疫共沉淀检测VHL或HIF-1α表达。最后,我们将细胞分为三组:空载+HA-UB,Flag-Septin4+HA-UB组和Flag-Septin4+HA-UB+BAY85-3934组,然后用免疫共沉淀检测HA表达。结果:1.随着缺氧刺激时间的延长,心肌细胞活性逐渐降低,凋亡逐渐升高;另外,缺氧处理延长时Septin4表达也逐渐增多。2.无论给予缺氧多长时间处理,与空载组相比较,过表达Septin4组的心肌细胞活性都更低,凋亡率都更高;另外,给予缺氧24h处理后,与空载组相比较,Septin4蛋白表达量更高,凋亡相关蛋白cleaved caspase3表达量也更高。3.无论给予缺氧多长时间处理,与对照组相比较,敲减Septin4组的心肌细胞活性都更高,凋亡率都更低;另外,给予缺氧24h处理后,与对照组相比较,Septin4蛋白表达量更低,凋亡相关蛋白cleaved caspase3表达量也更低。4.稳定敲除Septin4心肌细胞中:Septin4表达量下降,HIF-1α蛋白表达量上升,细胞活力升高,细胞凋亡降低;稳定敲除Septin4心肌细胞中重新过表达Septin4:Septin4表达量上升,HIF-1α蛋白表达量下降,细胞活力降低,细胞凋亡升高。5.未给予缺氧刺激时,Septin4与HIF-1α可以相互结合;在给予缺氧刺激时,Septin4与HIF-1α的结合作用得到增强;通过构建的截短序列,发现Septin4主要通过其GTPase结构域与HIF-1α结合。6.梯度过表达Septin4时,随着Septin4表达量上升,HIF-1α表达量下降;转染Septin4 si RNA不同序列时,当Septin4表达量下降,HIF-1α表达量上升;CHX实验中,实验组和对照组HIF-1α下降速度几乎一致;MG132实验中,实验组HIF-1α量的积累明显比对照组快而明显。7.在MG132刺激下,Septin4与HIF-1α结合增强;过表达Septin4增强HIF-1α泛素化水平,敲减Septin4减弱HIF-1α泛素化水平。8.BAY85-3934抑制剂挽救Septin4下调的HIF-1α表达;过表达Septin4增强HIF-1α与VHL结合,敲减Septin4减弱HIF-1α与VHL结合;BAY85-3934抑制剂减弱Septin4增强的HIF-1α泛素化水平。结论:1.缺氧刺激可以引起Septin4蛋白表达量的增加。过表达Septin4加重缺氧诱导的心肌细胞损伤,敲减Septin4减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤。2.Septin4通过降低心肌保护因子HIF-1α的表达加重缺氧诱导的心肌细胞损伤。3.Septin4通过其GTPase结构域与HIF-1α结合,并且在缺氧刺激下结合增强。4.Septin4通过蛋白酶体途径降低HIF-1α稳定性。5.Septin4增强HIF-1α泛素化水平。6.Septin4通过增强E3泛素化连接酶VHL与HIF-1α的结合,促进HIF-1α的UPS途径降解,从而参与缺氧诱导的心肌细胞损伤。