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目的:一次饮入过量酒精或酒类饮料引起兴奋继而抑制的状态称为急性酒精中毒。由急性酒精中毒导致的急性酒精性心肌损伤的发生率正逐年升高,但目前仍缺乏强有效的治疗手段和药物,这引起了临床医生的广泛关注。近年来,研究发现酒精引起的心肌过度凋亡是急性酒精性心肌损伤的主要发病机制之一。核仁蛋白66(Nucleolar protein 66,NO66,又名核糖体加氧酶1),可以参与凋亡的调节且对酒精处理后的应答起关键作用,然而NO66是否以及如何参与酒精诱导的心肌凋亡有待于进一步的探究。目前临床上针对急性酒精性心肌损伤的治疗仅包括戒酒以及对心衰、心律失常等临床表现的对症治疗。近年来,抑制心肌凋亡已经逐步成为拓展急性酒精性心肌损伤治疗思路的新方向。因此,具有抗凋亡作用的中药单体受到了广泛关注。丹参酮IIA是从丹参中提取到的具有抗凋亡,抗炎,抗氧化作用的药物活性成分,但其在急性酒精诱导的心肌凋亡中的作用还未有研究。综上,本研究旨在探索NO66在酒精诱导心肌细胞凋亡中的作用机制和丹参酮IIA对急性酒精诱导心肌凋亡的保护作用。为临床上防护酒精性心肌损伤提供新靶点和新策略。研究方法:第一部分:实验选用AC16心肌细胞系进行研究,给予细胞含不同浓度酒精培养液培养后,通过CCK-8法检测细胞活力、LDH法检测细胞损伤水平、流式细胞术检测细胞凋亡水平、Western blot法检测凋亡蛋白表达水平后选取合适的酒精浓度建立酒精诱导AC16心肌细胞凋亡模型。应用Western blot及RT-q PCR法检测细胞内NO66、凋亡相关蛋白的表达水平。将NO66过表达质粒转染到AC16细胞,后对细胞进行LY294002干预和酒精处理。利用流式细胞术检测细胞凋亡水平、Western blot法检测PI3K/Akt通路相关分子的表达水平。将PTEN过表达质粒和NO66过表达质粒共转染到AC16细胞中,后对细胞进行酒精处理。利用流式细胞术检测细胞凋亡水平,RT-q PCR法检测PTEN、NO66的m RNA表达水平,Wetern blot法检测PTEN、NO66、pAkt、Akt的蛋白表达水平。第二部分:建立C57BL/6小鼠急性酒精性心肌损伤模型。随机选取同样数量的小鼠设置正常对照组,酒精组,低浓度丹参酮IIA组,丹参酮IIA组。行心脏彩超后,处死小鼠取材,测量小鼠的体重以及心脏重量,给予心肌HE染色后进行病理学评分以评估不同实验组之间组织病理学改变的组间差异水平。对各组小鼠的心肌组织进行TUNEL染色,计算心肌的凋亡率。应用Western blot法对心肌组织的Akt磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平进行检测。第三部分:利用H9c2心肌细胞系进行研究。给予细胞含不同浓度酒精培养液培养后,采用与第一部分相似的方法选取合适的酒精浓度建立酒精诱导H9c2心肌细胞凋亡模型。给予细胞由低至高浓度丹参酮IIA处理。应用CCK-8法检测细胞活力以评估丹参酮IIA对H9c2细胞的毒性作用。在酒精诱导H9c2心肌细胞凋亡模型中给予丹参酮IIA干预,利用CCK-8法检测细胞活力以筛选出丹参酮IIA最适药物浓度和丹参酮IIA在该浓度下的最适作用时间。在酒精诱导H9c2心肌细胞凋亡模型中给予不同浓度的丹参酮IIA干预,应用流式细胞术检测细胞凋亡水平。利用Western blot法对细胞中的Akt磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平进行检测。应用PI3K特异性抑制剂LY294002干预细胞后,再对H9c2细胞进行酒精和丹参酮IIA的处理,然后用流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blot法检测细胞中的Akt磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平。研究结果:第一部分:NO66在酒精诱导AC16心肌细胞凋亡中作用机制的研究1.含不同浓度(100、200、400、800 m M)酒精的培养液培养24 h对AC16细胞有损伤作用,我们选择用400 m M酒精浓度培养液培养24 h作为酒精诱导AC16心肌细胞凋亡模型。酒精处理后,细胞的NO66表达水平下降、pAkt/Akt和Bcl-2/Bax比值降低,PTEN,p53,cleaved caspase-3表达水平升高。2.NO66过表达减少急性酒精诱导的AC16细胞凋亡。NO66过表达逆转急性酒精诱导的细胞pAkt/Akt和Bcl-2/Bax的比值下降,同时降低急性酒精导致的PTEN,p53,cleaved caspase-3的水平升高。LY294002干预降低了NO66过表达引起的细胞pAkt/Akt和Bcl-2/Bax比值增加,逆转了NO66过表达引起的p53,cleaved caspase-3水平降低。3.PTEN过表达可以导致pAkt/Akt比值下降,但并未影响NO66的表达水平。NO66过表达可以抑制酒精诱导的PTEN表达升高,逆转酒精诱导的pAkt/Akt比值降低。同时过表达PTEN和NO66后,较NO66过表达相比,减弱了NO66对酒精诱导心肌细胞凋亡的保护作用,同时逆转了NO66导致的pAkt/Akt水平升高。第二部分:从动物水平观察丹参酮IIA对酒精诱导心肌损伤的影响1.正常对照组,酒精组,低浓度丹参酮IIA组,丹参酮IIA组的小鼠体重和心脏重量无明显差异。酒精组较正常对照组相比,小鼠心脏的左室缩短分数(FS)、射血分数(EF)下降,左室收缩末期内径(LVESD)增加。在此基础上给予递增浓度梯度的丹参酮IIA可以逐渐改善酒精导致的小鼠FS、EF下降和LVESD增加。2.急性酒精暴露引起小鼠心肌损伤,但在此基础上给予递增浓度梯度的丹参酮IIA后小鼠的心肌损伤逐渐改善。3.酒精组较正常对照组相比,小鼠心肌的凋亡水平增高。但在此基础上给予递增浓度梯度丹参酮IIA后,较酒精组相比,小鼠心肌凋亡水平逐渐减低。4.酒精组较正常对照组相比,小鼠心肌的cleaved caspase-3和p53表达水平升高,pAkt/Akt和Bcl-2/Bax比值降低。但在此基础上给予递增浓度梯度丹参酮IIA治疗后,较酒精组相比,小鼠心肌的cleaved caspase-3和p53的表达水平逐渐降低,pAkt/Akt和Bcl-2/Bax的比值逐渐增加。第三部分:从细胞和分子水平探讨丹参酮IIA对酒精诱导心肌凋亡的作用机制1.含不同浓度(50、100、200、400 m M)酒精的培养液培养24 h对H9c2细胞有损伤作用,我们选择用200 m M酒精浓度培养液培养24 h作为酒精诱导H9c2心肌细胞凋亡模型。丹参酮IIA(0.3μM、1μM、3μM、10μM和30μM)对H9c2细胞无毒性。10μM的丹参酮IIA对酒精导致H9c2细胞损伤的抑制作用最强,且在该浓度下其抑制作用随时间延长而增强。因此选择10μM作为后续实验中丹参酮IIA的最适药物浓度,24 h作为丹参酮IIA最适作用时间,3μM作为丹参酮IIA的低药物浓度对照。2.急性酒精处理导致H9c2细胞凋亡水平增高,但加入递增浓度梯度丹参酮IIA干预,较酒精处理组相比,H9c2细胞的凋亡水平逐渐下降。3.酒精处理组较正常组相比,细胞的cleaved caspase-3和p53表达水平升高,pAkt/Akt和Bcl-2/Bax比值降低。但加入递增浓度梯度丹参酮IIA干预,较酒精处理组相比,细胞的cleaved caspase-3和p53的表达水平逐渐降低,pAkt/Akt和Bcl-2/Bax的比值逐渐增加。4.LY294002+丹参酮IIA组与丹参酮IIA组相比,酒精诱导的细胞凋亡水平增高,细胞的pAkt/Akt和Bcl-2/Bax比值降低,cleaved caspase-3和p53水平升高。结论:1.NO66过表达可以通过降低PTEN表达进而激活Akt的磷酸化,从而保护酒精诱导的AC16心肌细胞凋亡。2.丹参酮IIA可以在酒精诱导的小鼠心肌损伤中发挥抗凋亡的作用。3.丹参酮IIA是通过激活PI3K/Akt通路从而抑制酒精诱导的H9c2心肌细胞凋亡。