论文部分内容阅读
对比剂肾病（Contrast induced nephropathy,CIN）或对比剂急性肾损伤（Post-Contrast Acute Kidney Injury,PC-AKI）是指使用含碘对比剂后72h之内发生的急性肾功能损伤,包括排除其他原因的新发的肾脏功能损伤或之前存在的肾脏功能损伤加重。目前,专家共识的诊断标准是血肌酐（Serum creatinine,Scr）比基础水平升高25%或者Scr超过44μmol/L（5mg/L）[1]。最近几年,由于医学影像技术学的发展,使得含碘对比剂的使用率越来越高;另外,在心脑血管与肿瘤疾病的介入治疗中,含碘对比剂的使用量往往较大,导致PC-AKI已经成为医源性肾功能不全的第三大病因[2]。PC-AKI常发生在伴有心脑血管或慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）等基础疾病的患者,特别是高龄患者;常给患者带来一系列严重的不良后果。一些观察性研究已经证实了PC-AKI长期的负面结果,如增加死亡风险、进展为CKD/终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）等[3,4]。因此,PC-AKI已经引起广泛的重视。PC-AKI的发病机制复杂。目前研究报道,在PC-AKI的发生中,氧化应激、肾脏微循环的改变、氧耗增加（特别是低氧分压区）导致髓质的缺氧、碘对比剂对肾小管以及内皮细胞的细胞毒性作用等多种因素可能参与其中[5,6]。其中,氧化应激在PC-AKI发生中起着至关重要的作用。在活性氧（Reactive oxygenspecies,ROS）生成方面,碘对比剂既可以引起ROS过量生成,也可以使ROS的清除降低,导致氧化应激增加,引起肾功能受损。一方面,注入碘对比剂可以引起内皮素的生成增加,一氧化氮（Nitric oxide,NO）、前列腺素的生成降低,导致血管收缩舒张紊乱,通过改变肾脏的微循环情况,引起肾脏缺血缺氧（特别是髓质区）,进而通过黄嘌呤氧化酶这一途径导致ROS的产生。另一方面,碘对比剂还可以通过降低肾脏皮质内抗氧化酶的活性,导致ROS的产生。增加的ROS将会导致多元不饱和脂肪酸脂质过氧化,产生4-羟基壬稀酸（4-hydroxy-trans-2-nonenal,4-HNE）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等醛类物质[7],这些醛类物质具有明显的细胞毒性作用,并且其性质比ROS稳定,能够弥散到多处组织器官中,从而使得氧化损伤效应得到放大。因此,寻找有效的能够阻断氧化应激反应的干预策略,对于预防PC-AKI的发生具有重要的临床意义。线粒体乙醛脱氢酶2（Mitochondrial acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）作为一种四聚体酶,其分布具有组织特异性,在肾脏、肝脏、心脏等器官组织中广泛表达。ALDH2的主要作用是对醛类物质的解毒;ALDH2通过对醛类物质的代谢进而产生抗氧化应激、抗凋亡等作用。小分子物质Alda-1作为ALDH2的特异性激动剂,可以特异性激活ALDH2发挥保护作用。研究报道,在肾脏缺血再灌注损伤（Ischemia reperfusion injury,IRI）模型中,预先给予生理水平的乙醇预处理,可保护肾小管上皮细胞免受缺血再灌注损伤,而这种保护作用被证实与乙醇促进ALDH2的生成,抗氧化能力增强有关[8]。在低温诱导的肾脏IRI中,ALDH2的表达增加可以减少肾细胞凋亡[9]。然而,抑制ALDH2表达则可加重脓毒症大鼠肾脏损伤[10]。除了在肾脏方面的研究,Bai等发现ALDH2在神经细胞的损伤中也具有保护作用,其通过抑制ROS的产生、降低凋亡蛋白的表达,进而保护神经细胞免受4-HNE导致的损伤[11]。对于心肌细胞,研究发现ALDH2高表达后,通过增强对乙醛和乙醇的代谢,进而抑制了其诱导的ROS的生成并减轻了心肌细胞的凋亡;在缺血前采用乙醛脱氢酶2激动剂Alda-l和乙醇预处理能够减少4-HNE的积聚,使心肌梗死面积减少60%[12]。因此,目前ALDH2被认为是一种重要的内源性保护因子,在抗氧化应激方面发挥着重要的作用,有望成为预防PC-AKI的新靶点。随着磁共振技术不断进步,磁共振功能成像（Functional magnetic resonance imaging,f MRI）能够在肾脏病理学结构发生异常前,无创性的做出肾功能异常的诊断。因此,f MRI作为一种无创性的检查手段可以为许多疾病的早期发现和早期诊断提供强有力的方法。血氧水平依赖成像（Magnetic resonance imaging-blood oxygenation level dependent,MRI-BOLD）技术是基于组织中氧合血红蛋白和去氧血红蛋白的比例来成像的[13]。目前,已有研究报道MRI-BOLD可以早期评价糖尿病实验兔模型下的碘对比剂肾损伤,并能无创性评价PC-AKI肾脏氧含量的动态变化[14]。体素内不相干运动（Intravoxel incoherent motion,IVIM）磁共振成像不仅可以检测组织水分子扩散,还可以同时反映出组织毛细血管灌注情况。文献报道,IVIM技术在PC-AKI中不仅可以动态的观察水分子扩散的情况,还可以有效的监测PC-AKI中肾血管的收缩、扩张以及液体负荷增加情况[14]。因此,我们推测联合采用BLOD与IVIM成像技术可以用来评估、监测ALDH2对PC-AKI的保护价值。摘要一目的:探索ALDH2在PC-AKI中的表达变化及其保护作用,评价BLOD联合IVIM成像技术监测ALDH2对PC-AKI保护作用的价值。研究方法:对新西兰大耳兔以8.0 g I/Kg经耳缘静脉注射碘海醇,建立PC-AKI模型。将实验兔随机分为4组:对照组（生理盐水）、Alda-1组、碘对比剂肾损伤组（PC-AKI）以及Alda-1+碘对比剂肾损伤（A+PC-AKI）,每组6只。其中,Alda-1组与A+PC-AKI组首先以5 mg/Kg/d经灌胃器连续灌注ALDH2的激动剂Alda-1 7天;第8天各组实验兔经耳缘静脉注射生理盐水或碘海醇。24h后,充分麻醉实验兔,自耳缘静脉采集静脉血检测血肌酐（Serum creatinine,Scr）、尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）,并行BOLD和IVIM磁共振检查。扫描完成后处死实验兔获取肾脏组织行HE和TUNEL染色;Western blot检测各组间ALDH2、4-HNE、超氧化物解化酶2（Superoxide dismutase 2,SOD-2）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和Cleaved-Caspase-3的表达变化;采用硫代巴比妥酸法（Thiobarbituric acid method,TBA）测定MDA含量。首先将人肾小管上皮细胞HK-2分别在含0mg I/ml、5mg I/ml、10mg I/ml、20mg I/ml、40mg I/ml、80mg I/ml、160mg I/ml碘海醇的1640培养基中培养1h、12h、24h、48h,利用细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK8）检测碘对比剂对HK-2细胞的增殖抑制率。然后,取处于对数生长期的HK-2细胞,将HK-2细胞在含有半数抑制率浓度（80mg I/ml）碘海醇的1640培养基中培养1h,12h,24h,48h后收集细胞,Western Blot检测ALDH2、4-HNE蛋白表达情况。其次,将HK-2细胞随机分为4组:对照组（甘露醇）、碘海醇组、Alda-1+碘海醇组及ALDH2抑制剂Daidzin+碘海醇组。给予相应干预处理后收集细胞,采用Western Blot检测各组ALDH2、4-HNE、SOD-2、CAT、Cleaved-Caspase3蛋白表达变化;TBA法测定MDA含量;利用DAPI染色观察细胞凋亡;利用荧光酶标仪检测细胞内ROS荧光信号的强度。结果:成功建立PC-AKI实验兔模型。PC-AKI组Scr和BUN升高,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.001,P=0.001）;与PC-AKI组比较,A+PC-AKI组Scr和BUN下降,差异具有统计学意义（P=0.027,P=0.035）。f MRI结果显示,无论在肾脏皮质区还是髓质区,PC-AKI组R2*值升高,D、D*、f值降低,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001）。在皮质区,与PC-AKI组相比,A+PC-AKI组R2*降低,D、D*、f值升高,两组间R2*、D、f值差异具有统计学意义（P<0.001,P=0.0017,P=0.028）。在髓质区,与PC-AKI组相比,A+PC-AKI组R2*值降低,D、D*、f值升高,差异具有统计学意义（P<0.001,P=0.001,P<0.001,P<0.001）。HE及TUNEL染色显示,Alda-1组与对照组的病理损伤评分与凋亡率差异无统计学意义（P=0.119,P=0.601）;与对照组比较,PC-AKI组病理损伤评分及凋亡率升高,两组间差异具有统计学意义（P<0.001,P<0.001）;相比PC-AKI组,A+PC-AKI组肾脏病理损伤评分及凋亡率降低（P=0.014,P=0.001）。Western Blot结果进一步验证了Alda-1激活ALDH2后可以减轻碘对比剂诱导的肾小管上皮细胞凋亡;与PC-AKI组比较,A+PC-AKI+组Cleaved-Caspase3蛋白表达降低,差异具有统计学意义（P=0.005）。另外,与对照组相比,PC-AKI组ALDH2（P=0.002）、SOD-2（P<0.001）及CAT（P<0.001）蛋白表达降低,4-HNE（P<0.001）蛋白表达升高,MDA含量升高（P<0.001）。然而,相比PC-AKI组,A+PC-AKI组ALDH2（P<0.001）、SOD-2（P=0.015）及CAT（P=0.008）蛋白升高,4-HNE蛋白表达降低（P=0.001）,MDA含量降低（P=0.008）。体外实验中,CCK-8实验显示随着碘对比剂作用浓度、作用时间的增加,碘对比剂对HK-2细胞的增殖抑制增强;并且随着作用时间的延长,Western Blot显示,ALDH2蛋白表达逐渐降低,4-HNE蛋白表达逐渐升高。与碘海醇组相比,Alda-1+碘海醇组ROS水平与MDA含量降低（P<0.001,P=0.005）,4-HNE（P=0.024）、Cleved-Caspase3（P=0.02）蛋白表达降低,ALDH2（P<0.001）、SOD-2（P<0.001）及CAT蛋白表达（P<0.001）升高。DAPI结果与Cleved-Caspase3蛋白表达变化结果一致。而ALDH2的抑制剂Daidzin将显著地降低ALDH2对肾损伤的保护作用。与对照组相比,Daidzin+碘海醇组ALDH2（P=0.015）、SOD-2（P<0.001）和CAT（P=0.004）蛋白表达下降,4-HNE（P=0.002）、Cleaved-Caspase3（P<0.001）显著升高,ROS和MDA含量升高（P<0.001,P<0.001）。结论:ALDH2在PC-AKI中发挥抗氧化应激的作用,其作用机制可能与ALDH2通过抑制4-HNE和MDA积累或抑制ROS的生成有关;BOLD联合IVIM成像技术可以评估ALDH2对PC-AKI的保护作用。摘要二目的:探讨ALDH2是否通过调控AMPK/FoxO1信号通路参与在PC-AKI中抗氧化应激的保护作用。研究方法:首先将人肾小管上皮细胞HK-2分为4组:对照组（甘露醇）、碘海醇组、AMPK激动剂GSK621+碘海醇组以及AMPK抑制剂Compoud C+碘海醇组。Western Blot检测各组AMPK、p AMPK、FoxO1、p FoxO1蛋白表达情况。然后,将HK-2细胞分为5组:对照组、碘海醇组、Alda-1+碘海醇组、Daidzin+碘海醇组、Alda-1+Compoud C+碘海醇组。Western Blot检测各组AMPK、p AMPK、FoxO1、p FoxO1、CAT、SOD-2蛋白表达情况,并利用荧光显微镜检测胞内ROS荧光信号的强度。结果:与对照组比较,碘海醇组p AMPK、FoxO1蛋白表达降低,p FoxO1蛋白表达升高,差异具有统计学意义（P=0.014,P=0.03,P=0.012）。与碘海醇组比较,GSK621+碘海醇组p AMPK、FoxO1蛋白表达升高（P=0.019,P=0.034）,p FoxO1蛋白表达降低（P=0.006）,而Compound C+碘海醇组p AMPK、FoxO1蛋白表达降低,p FoxO1蛋白表达升高,差异无统计学意义（P=0.080,P=0.966,P=0.524）。另外,与碘海醇组比较,Alda-1+碘海醇组p AMPK、FoxO1、CAT、SOD-2蛋白表达水平升高,p FoxO1蛋白表达降低,差异具有统计学意义（P=0.001,P=0.006,P=0.019,P=0.002,P=0.022）。Daidzin可逆转Alda-1的作用。此外,经AMPK抑制剂Compound C和Alda-1共同干预后,Alda-1+Compound C+碘海醇组FoxO1、CAT、SOD-2的蛋白表达水平降低,p FoxO1蛋白表达升高,与Alda-1+碘海醇组差异具有统计学意义（P=0.018,P=0.001,P=0.02,P=0.018）,但与碘海醇组间差异无统计学意义（P=0.986,P=0.563,P=0.522,P=0.925）。ROS结果与蛋白表达结果相一致,碘海醇组ROS水平升高,与对照组差异具有统计学意义（P<0.001）;与碘海醇组比较,Alda-1+碘海醇组ROS水平明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）。然而,AMPK抑制剂Compound C和Alda-1共同干预后,Alda-1+Compound C+碘海醇组ROS水平较Alda-1+碘海醇组明显增加,差异具有统计学意义（P<0.001）,与碘海醇组比较差异无统计学意义（P=0.499）。结论:AMPK/FoxO1信号通路参与PC-AKI,ALDH2在PC-AKI中发挥抗氧化应激的保护作用可能与其调控AMPK/FoxO1信号通路有关。