1.禽致病性大肠杆菌的分离鉴定从江苏省及周边城市的兽医站、养殖场,采集发生败血性的病死禽的内脏,无菌处理病料表面,采用常规三区划线分离细菌。通过10项生化鉴定,最终得到195株APEC菌株。用标准的大肠杆菌O血清型多因子血清及单因子血清,采用玻板和试管凝集试验,对所分离得到的菌株进行O血清型鉴定。结果发现,从禽体内分离得到的菌株的O血清型种类为53种,这已经突破以往报道的禽体内分离菌血清种类数。主要O血清型依次为O78、O88、O9、O93、O24、O109、O86,从不同地区分离得到的菌株的血清型种类和主要血清型有所不同、不同宿主来源的分离株的O血清型种类和优势血清型也存在一定的差异。O78血清型在大部分地区的分离菌株中都是主要血清型,然而本次试验中,在广西和扬州分离株中,却没有发现O78血清型的菌株。鸡源菌株的主要血清型为O78、O109、O88、O86,鹅源菌株的主要血清型则为O9,O93二种血清型。此外,O114、O118、O123、O141、O23、O73等六种血清型也只出现于鹅源菌株,O143血清型只出现于鸭源菌株,O109等28种血清型只在鸡源菌株中出现。只有O11、O107三种血清型在三种家禽分离株中均出现。2.禽致病性大肠杆菌药物敏感性根据目前临床上治疗大肠杆菌病的常用抗生素,选择19种抗生素纸片,采用K-B圆纸片法,对以上分离所得的195株细菌的药物敏感性进行测定。试验结果参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)规定的判断标准,进行统计分析。结果表明,目前临床上的APEC分离株耐药现象已经很严重,细菌的多重耐药十分普遍,将近90%的分离菌株能抗8种以上抗生素。分离菌株对氟哌酸、环丙沙星、恩诺沙星、复方新诺明、壮观霉素、四环素、链霉素、阿奇霉素、利福平等药物的耐药率均超过了70%。磷霉素、头孢曲松、头孢噻肟等一些新特药对目前的临床分离菌株具有很好的抗菌治疗效果,同时我们还发现多粘菌素对APEC的抗菌效果最好,目前临床分离菌暂时没有耐多粘菌素的菌株发现。分离自不同地区的受试菌株对药物的耐受情况不同,按一定的顺序将抗生素进行排列,结果发现菌株的耐药排列组合与其分离来源地存在一定的相关性,但与宿主来源没有明显的相关性。3.禽致病性大肠杆菌毒力相关基因的分子流行病学调查研究根据网上已经公布的与禽致病性大肠杆菌致病过程中相关的基因的序列,参照有关文献报道,分别设计特异性PCR扩增引物13对,采用常规PCR方法,获得相应的毒力基因,并进行序列分析。将与标准序列同源性达到95%以上的菌株作为阳性对照菌株,建立PCR检测方法,对195株APEC的13种毒力基因进行分子流行病学调查。结果发现,不同基因的检测率存在很大的差别。分属于黏附系统和摄铁系统的fimC和iucD基因的检出率很高,分别达到93.8%、71.8%,说明黏附和铁对APEC的致病性很重要。同处于HPI毒力岛的结构基因irp2和fyuA,在同一菌株中同时存在,阳性率为45.1%。相比之下,papC, hlyE基因的检出率分别只有7.2%和4.1%。Stx2f、Vat、astA、colV、Tsh和Iss基因的检出率依次升高,分别为15.4%、26.2%、30.3%、34.9%、50.8%和60.0%。属于LEE毒力岛结构基因的eae基因尚没有检出。irp2和fyuA基因,在O78血清型菌株中的阳性率高达94.7%,明显高于其他优势血清型菌株。同样的现象也出现在stx2f和vat两个基因上,它们在O11血清型菌株的阳性率(66.7%)也远远高于其他血清型菌株同时实验结果还显示,papC基因主要出现在O2、O24两种血清型菌株中。将菌株携带毒力基因进行统计后,发现有32个分离株共同拥有fimC-iucD-irp2-fyuA-iss-colV-tsh基因组合模式,占总分离株的16.4%。优势血清型菌株所具有的毒力基因组合模式明显要比非优势血清型菌株的少,说明毒力基因的组合模式与血清型具有一定的相关性。4.野生大肠杆菌分离菌株对磷霉素的耐药机制通过前面的药敏试验,我们发现了三株耐磷霉素的野生大肠杆菌。这三株细菌对磷霉素的MIC值测定实验,表明其中两株(JE1、CD11)对磷霉素极度抵抗,分别达到125000μg /ml和51200μg /ml,另一株(IF7)属于中度耐药,为1280μg /ml。为了检测耐药菌细胞壁转运磷霉素的生物通道(glpT转运系统和Uhp系统)的突变情况和摄取抗生素的能力,分别将耐药菌接种在极限培养基中,测定其生长情况,并提取细菌的胞内液,检测其中含有活性磷霉素的浓度。实验反映,IF7菌株的glpT转运系统发生了变化,对磷霉素的转运效率下降,是导致其对磷霉素的中度耐药的主要原因;细菌胞内活性磷霉素浓度测定结果提示我们,CD11菌株对磷霉素的摄取能力很低,可能是导致其对磷霉素高度耐药的机制之一,而IF7菌株的摄取能力因为glpT系统的突变而变得相对较低。针对磷霉素在细菌胞内作用靶蛋白的编码基因murA,设计特异性引物,运用常规PCR方法扩增获得该基因,并与标准序列进行序列比较分析,以鉴定该基因是否存在突变。以此同时,纯化获得的murA基因,将其插入到表达性载体pET32a,并转入表达性宿主菌BL21a(DE3)中构建重组菌,测定重组菌对磷霉素的MIC值,以说明存在的突变是否能引起对磷霉素的耐药发生。murA基因序列比较分析结果显示,CD11菌株在第116位氨基酸发生突变,并最终表现该基因的重组菌对磷霉素高度耐药,这是其高度耐药的又一原因。有趣的是,JE1菌株该基因在氨基酸水平上没有发生变化,但由其构建的重组菌却对磷霉素高度耐药。提取耐药菌的RNA,并进行RT-PCR获得cDNA,以cDNA为模板,以细菌的16sRNA为内参照,采用SYBR Green荧光染料染色法,建立荧光定量PCR方法,对耐药菌murA基因的表达水平差异情况进行比较。结果发现三株耐药菌murA基因的表达水平都比阴性对照菌BL21要高。其中,JE1菌株该基因的表达水平最高,比IF7和CD11菌株的表达水平约高两倍,比BL21菌株约高四倍,这可能就是该菌株的主要耐药原因所在。IF7和CD菌株murA基因表达水平相当,约是对照菌BL21表达水平的两倍。由此,可以看出这三株耐磷霉素野生大肠杆菌的耐药机制各不相同,说明细菌的耐药机制复杂多样,这将为我们将来的研究工作提供很好的研究思路和研究方法。