二倍体马铃薯的组培再生体系建立及抗性相关基因的遗传转化

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jiaoxuepan
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以二倍体马铃薯不同基因型的茎段外植体为材料,建立了离体再生体系和转基因技术体系;构建StPMEI基因的过量表达载体转化马铃薯二倍体感病基因型ED25,StPMEI反义基因表达载体以及StPMEI、StPI和StRLK基因的RNAi表达载体转化二倍体抗病基因型ED13,获得了转基因再生植株37棵,其中15棵已经进行了PCR的初步鉴定。   分别以二倍体马铃薯抗病基因型ED13、CE171和感病基因型ED25的茎段为外植体,在优化植物激素浓度及配比等的基础上,对不同基因型的组培再生进行了研究和探讨,结果表明:不同的基因型具有不同的激素及浓度配比要求。固体—液体培养基双层看护培养对于二倍体马铃薯茎段愈伤组织的诱导是必要的,尤以固体培养基中NAA和6-BA的浓度配比2∶2为佳。对于ED13而言,液体培养基中2,4-D和KT的浓度配比2.5∶0.5为佳,相比之下对于CE171,则以1.5∶1为最好,二者的愈伤诱导率均达100%;然而对于基因型ED25,只有在NAA和6-BA的浓度配比2∶1,2,4-D和KT的浓度配比1.5∶1时才能形成较好的愈伤。ZT在愈伤组织诱导不定芽分化过程中具有重要作用,单独使用ZT,浓度为1mg/L时,ED13和CE171的芽分化率均可达95%以上;而对于ED25,则只有在ZT和6-BA配合使用,浓度配比为0.5∶2.5时才可获得较高的芽分化率。   以ED13基因组DNA为模板,利用基因特异引物进行PCR扩增,分别获得了StPMEI、StPI和StRLK基因的完整编码区及相应的用于RNAi的基因片段,经T-A连接后,转化受体菌获得了DH5α阳性重组子。进一步酶切及连接后,成功地构建了StPMEI正、反义全长基因的植物表达载体pBI-PMEI和pBI-AS-PMEI及RNAi植物表达载体pCH-PMEI、pCH-PI和pCH-RLK,转化农杆菌LBA4404后进行马铃薯的快速基因转化,获得了预期转化子37株,其中15株已经进行了PCR检测确定为阳性,其它的22株尚待检测确定。   影响茎段外植体转化效率的因素很多。研究表明:预培养2d,菌液OD600为0.5,侵染时间10min,共培养时间2d,可获得较好的转化效果。合适的抗生素筛选压对于转基因植株的选择至关重要:对于抗病基因型ED13而言,卡那霉素(Km)和庆大霉素的筛选浓度均以50mg/L为佳,而对于感病基因型ED25,Km筛选浓度则以30mg/L为佳。在转基因植株的筛选过程中,农杆菌抑菌剂特美汀(Tim)的浓度以150mg/L抑菌效果最好,不但可以完全抑制农杆菌生长,而且具有较高的芽诱导率。
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