【摘 要】
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Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是先天免疫系统重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR),它属于Ⅰ型跨膜蛋白。这类受体在机体的先天免疫应答中具有
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Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是先天免疫系统重要的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR),它属于Ⅰ型跨膜蛋白。这类受体在机体的先天免疫应答中具有识别入侵的病原微生物,引起机体炎症反应从而有助于清除病原的重要作用。目前已经识别了10种鸡的Toll样受体(chicken toll-like receptor, chTLRs)。本课题通过设计4对引物分别对chTLR2家族的4个成员1LA、1LB、2t1和2t2的含ORF全长基因序列进行扩增,并串联Lumio标签序列。将扩增基因片段克隆进真核表达载体pVITRO1-neo-mcs,通过PCR和双酶切鉴定,证实成功构建了pVITRO1-neo-mcs-chTLR1LA、1LA、2t1和2t2四个重组真核表达质粒。并将这些重组质粒单个和两两组合共10组分别稳定转染Vero细胞,通过RT-PCR、蛋白PAGE凝胶电泳(Lumio融合蛋白)对重组质粒的表达情况进行检测。检测结果显示,成功获得了能够稳定表达重组质粒的T1-T10 vero细胞系。将检测质粒pNiFty2-SEAP稳定转染T1-T10Vero细胞株,构建T1’-T10’Vero细胞系,分别以含10μg/mL的LPS和Zymosan的HEK-BlueTM Detection刺激T1’-T10’Vero细胞系,同时设定无刺激对照组、阴性对照组(vero细胞转染检测质粒)和空白对照组。刺激9h后观察颜色变化并测定其OD值。LPS刺激组中的T1’、T3’和T9’Vero细胞株,Zymosan刺激组中的T9’Vero细胞株,无刺激对照组中的T4’和T8’Vero细胞株的分泌型碱性磷酸酶浓度(SEAP)均与极显著高于阴性对照组(P<0.01)。本课题研究结果表明,在chTLR2家族对LPS识别过程中,可能需要chTLR1LA单体、chTLR2t1单体和chTLR1LA与chTLR1LB复合物的参与；在chTLR2家族对Zymosan识别过程中,可能需要chTLR1LA与chTLR1LB复合物的参与；而无刺激对照组的检测结果表明,chTLR2t2单体活化NF-κB的作用比实验中所采用的其它单体和复合物更强,说明chTLR2t2单体可能对某些病原具有配体识别功能。
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