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旋毛形线虫(Trichinella spiralis)又称为旋毛虫,旋毛虫可以感染绝大多数的哺乳动物,大部分的爬行动物和鸟类,旋毛虫病是由旋毛虫引起的全球性的人畜共患病,人感染旋毛虫病是由于生食或半生食含有旋毛虫的猪,马和野生动物的肉引起的。旋毛虫感染成虫期可引起广泛的炎症和Th1型免疫应答,随着旋毛虫新生幼虫在宿主体内不断地发育,宿主的免疫类型逐渐由Th1型免疫应答向Th2型免疫应答转变,当新生幼虫发育为肌幼虫时宿主的免疫类型转为Th2型应答并抑制炎症的发生。研究显示线虫寄生和免疫类型转换与炎性小体有关。
炎性小体是近几年发现的一类由胞浆模式识别受体参与组装的多蛋白复合体,NLRP3炎性小体通过分泌IL-1β和IL-18促进Th1型免疫应答。在寄生虫病中,如果能够抑制NLRP3炎性小体的激活,可能会减少促炎因子的激活和释放,从而控制寄生虫病的发生发展,但是NLRP3炎性小体是否参与旋毛虫慢性感染及在感染中的免疫应答作用尚不清楚。为了探究NLRP3炎性小体是否在旋毛虫感染期间参与并发挥作用,我们首先建立旋毛虫小鼠感染模型,之后模型小鼠于不同时间点腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂,并运用ELISA、Westernblot、流式细胞术和免疫荧光等方法检测旋毛虫成虫期、移行期和肌幼虫期NLRP3炎性小体对旋毛虫寄生和免疫的影响;体外试验检测三个时期虫体蛋白对巨噬细胞NLRP3炎性小体的影响。研究内容及结果如下:
(1)NLRP3炎性小体对旋毛虫寄生的影响
首先为了确定NLRP3炎性小体是否参与旋毛虫感染,我们运用了NLRP3炎性小体抑制剂(MCC950),并将小鼠随机分为三组:Control组、旋毛虫感染组(TS组)和旋毛虫感染后腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂组(TS+MCC950组),运用ELISA试剂盒检测在成虫期(7d)、移行期(14d)和肌幼虫期(35d)内相关细胞因子IL-1β和IL-18及宿主免疫类型IgG1和IgG2的含量变化。实验结果显示:与TS组相比TS+MCC950组内的IL-18和IL-1β均降低(P<0.05),并且在成虫期和移行期IgG2的分泌量降低(P<0.001),肌幼虫期IgG1分泌量升高(P<0.01),这一结果说NLRP3炎性小体参与了旋毛虫的感染,NLRP3炎性小体在成虫期和移行期增强宿主Th1型免疫反应,在肌幼虫期减弱Th2型免疫反应。
为了确定NLRP3炎性小体在旋毛虫感染期间的作用,我们将小鼠分为三组:Control组、旋毛虫感染组(TS组)和旋毛虫感染后腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂组(TS+MCC950组),运用流式细胞术检测检测在成虫期、移行期和肌幼虫期时肠系膜淋巴结(MLN)和脾脏(SPL)内IL-4以及IFN-γ的变化,其结果显示TS+MCC950组与TS组相比,在成虫期引起MLN中IL-4升高(P<0.001)、IFN-γ降低(P<0.001),SPL中IFN-γ的降低(P<0.001),移行期引起MLN和SPL中IL-4升高(P<0.05),肌幼虫期引起MLN中IFN-γ的降低(P<0.05);用Westernblot、免疫荧光检测三组三个时期的小肠内NLRP3炎性小体的变化,结果显示:其小肠内的NLRP3炎性小体在成虫期和肌幼虫期TS+MCC950z组与TS组相比均降低;运用病理切片检测小肠和咬肌的病理变化,结果显示:TS+MCC950组与TS组相比,在成虫期、移行期和肌幼虫期时引起小肠内杯状细胞增多但炎症减少,在肌幼虫期肌纤维消失增多但炎症降低;并运用旋毛虫分离技术提取了TS组和TS+MCC950组成虫期和肌幼虫期的旋毛虫,结果显示:TS+MCC950组与TS组相比,在成虫期和肌幼虫期的虫体数量显著减少(P<0.05),以上结果说明在旋毛虫感染期间NLRP3炎性小体可以促进IFN-γ等促炎因子的释放、抑制IL-4等抑炎因子的释放,增加虫体存活量。
(2)旋毛虫虫体抗原对巨噬细胞内NLRP3炎性小体的作用
为了确定旋毛虫虫体抗原对巨噬细胞内NLRP3炎性小体的作用,首先我们将实验分为两组:用ATP和LPS诱导巨噬细胞的刺激组和用细胞培养基培养的PBS组,运用细胞间接免疫荧光法检测NLRP3炎性小体的表达,结果显示:相比于对照组,刺激组内的NLRP3炎性小体明显增多。以上结果说明:NLRP3炎性小体的激活需要ATP和LPS等炎性小体激活剂的刺激。
我们又将实验分为三组:单纯用ATP和LPS诱导巨噬细胞的对照组、用LPS诱导巨噬细胞后运用不同时期的旋毛虫蛋白(成虫期、移行期和肌幼虫期)刺激实验组和用LPS诱导巨噬细胞后用NLRP3炎性小体抑制剂MCC950抑制并运用不同时期的旋毛虫蛋白(成虫期、移行期和肌幼虫期)刺激的抑制剂组,运用免疫荧光检测NLRP3炎性小体的变化,结果显示:成虫蛋白、新生幼虫蛋白和肌幼虫蛋白刺激组相比于阳性对照组其NLRP3炎性小体含量减少,IL-18和IL-1β的分泌量显著降低(P<0.05);与抑制剂组相比NLRP3炎性小体含量增多,IL-18和IL-1β的分泌量极显著升高(P<0.001)。以上结果说明:成虫、新生幼虫和肌幼虫的虫体抗原可以激活巨噬细胞内的NLRP3炎性小体,使巨噬细胞分泌的细胞因子IL-18和IL-1β增多。
本实验初步证明了NLRP3炎性小体参与旋毛虫感染后的宿主免疫类型的转换及NLRP3炎性小体在旋毛虫感染期间促进宿主的炎症反应,应用不同生活史的旋毛虫虫体抗原刺激巨噬细胞,引起其NLRP3炎性小体的激活和促炎因子的释放,为旋毛虫感染后NLRP3的研究提供理论依据。
炎性小体是近几年发现的一类由胞浆模式识别受体参与组装的多蛋白复合体,NLRP3炎性小体通过分泌IL-1β和IL-18促进Th1型免疫应答。在寄生虫病中,如果能够抑制NLRP3炎性小体的激活,可能会减少促炎因子的激活和释放,从而控制寄生虫病的发生发展,但是NLRP3炎性小体是否参与旋毛虫慢性感染及在感染中的免疫应答作用尚不清楚。为了探究NLRP3炎性小体是否在旋毛虫感染期间参与并发挥作用,我们首先建立旋毛虫小鼠感染模型,之后模型小鼠于不同时间点腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂,并运用ELISA、Westernblot、流式细胞术和免疫荧光等方法检测旋毛虫成虫期、移行期和肌幼虫期NLRP3炎性小体对旋毛虫寄生和免疫的影响;体外试验检测三个时期虫体蛋白对巨噬细胞NLRP3炎性小体的影响。研究内容及结果如下:
(1)NLRP3炎性小体对旋毛虫寄生的影响
首先为了确定NLRP3炎性小体是否参与旋毛虫感染,我们运用了NLRP3炎性小体抑制剂(MCC950),并将小鼠随机分为三组:Control组、旋毛虫感染组(TS组)和旋毛虫感染后腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂组(TS+MCC950组),运用ELISA试剂盒检测在成虫期(7d)、移行期(14d)和肌幼虫期(35d)内相关细胞因子IL-1β和IL-18及宿主免疫类型IgG1和IgG2的含量变化。实验结果显示:与TS组相比TS+MCC950组内的IL-18和IL-1β均降低(P<0.05),并且在成虫期和移行期IgG2的分泌量降低(P<0.001),肌幼虫期IgG1分泌量升高(P<0.01),这一结果说NLRP3炎性小体参与了旋毛虫的感染,NLRP3炎性小体在成虫期和移行期增强宿主Th1型免疫反应,在肌幼虫期减弱Th2型免疫反应。
为了确定NLRP3炎性小体在旋毛虫感染期间的作用,我们将小鼠分为三组:Control组、旋毛虫感染组(TS组)和旋毛虫感染后腹腔注射NLRP3炎性小体抑制剂组(TS+MCC950组),运用流式细胞术检测检测在成虫期、移行期和肌幼虫期时肠系膜淋巴结(MLN)和脾脏(SPL)内IL-4以及IFN-γ的变化,其结果显示TS+MCC950组与TS组相比,在成虫期引起MLN中IL-4升高(P<0.001)、IFN-γ降低(P<0.001),SPL中IFN-γ的降低(P<0.001),移行期引起MLN和SPL中IL-4升高(P<0.05),肌幼虫期引起MLN中IFN-γ的降低(P<0.05);用Westernblot、免疫荧光检测三组三个时期的小肠内NLRP3炎性小体的变化,结果显示:其小肠内的NLRP3炎性小体在成虫期和肌幼虫期TS+MCC950z组与TS组相比均降低;运用病理切片检测小肠和咬肌的病理变化,结果显示:TS+MCC950组与TS组相比,在成虫期、移行期和肌幼虫期时引起小肠内杯状细胞增多但炎症减少,在肌幼虫期肌纤维消失增多但炎症降低;并运用旋毛虫分离技术提取了TS组和TS+MCC950组成虫期和肌幼虫期的旋毛虫,结果显示:TS+MCC950组与TS组相比,在成虫期和肌幼虫期的虫体数量显著减少(P<0.05),以上结果说明在旋毛虫感染期间NLRP3炎性小体可以促进IFN-γ等促炎因子的释放、抑制IL-4等抑炎因子的释放,增加虫体存活量。
(2)旋毛虫虫体抗原对巨噬细胞内NLRP3炎性小体的作用
为了确定旋毛虫虫体抗原对巨噬细胞内NLRP3炎性小体的作用,首先我们将实验分为两组:用ATP和LPS诱导巨噬细胞的刺激组和用细胞培养基培养的PBS组,运用细胞间接免疫荧光法检测NLRP3炎性小体的表达,结果显示:相比于对照组,刺激组内的NLRP3炎性小体明显增多。以上结果说明:NLRP3炎性小体的激活需要ATP和LPS等炎性小体激活剂的刺激。
我们又将实验分为三组:单纯用ATP和LPS诱导巨噬细胞的对照组、用LPS诱导巨噬细胞后运用不同时期的旋毛虫蛋白(成虫期、移行期和肌幼虫期)刺激实验组和用LPS诱导巨噬细胞后用NLRP3炎性小体抑制剂MCC950抑制并运用不同时期的旋毛虫蛋白(成虫期、移行期和肌幼虫期)刺激的抑制剂组,运用免疫荧光检测NLRP3炎性小体的变化,结果显示:成虫蛋白、新生幼虫蛋白和肌幼虫蛋白刺激组相比于阳性对照组其NLRP3炎性小体含量减少,IL-18和IL-1β的分泌量显著降低(P<0.05);与抑制剂组相比NLRP3炎性小体含量增多,IL-18和IL-1β的分泌量极显著升高(P<0.001)。以上结果说明:成虫、新生幼虫和肌幼虫的虫体抗原可以激活巨噬细胞内的NLRP3炎性小体,使巨噬细胞分泌的细胞因子IL-18和IL-1β增多。
本实验初步证明了NLRP3炎性小体参与旋毛虫感染后的宿主免疫类型的转换及NLRP3炎性小体在旋毛虫感染期间促进宿主的炎症反应,应用不同生活史的旋毛虫虫体抗原刺激巨噬细胞,引起其NLRP3炎性小体的激活和促炎因子的释放,为旋毛虫感染后NLRP3的研究提供理论依据。