奶牛妊娠的早期诊断对奶牛生产具有重要意义。对未妊娠母牛的误诊会错失其下一个发情期配种任务的安排，造成产犊间隔延长、繁殖率下降和产奶量降低等问题。对早期妊娠的检测方法有多种，临床上通常把血奶中孕酮的含量作为判断反刍动物怀孕事实的可靠依据。通过检测奶牛奶样或血样中类固醇含量可判断奶牛受精后一个月是否妊娠，但该方法对设备条件和技术要求高，费时，因此限制了在我国奶牛养殖户中的普及，不能满足当今检测需求。而单抗的制备使得对孕酮的检测更加快捷，优质的孕酮单克隆抗体制备出的胶体金试纸或用其建立的酶免疫检测方法都更加适用于中国大多数规模不大的养殖场。目前我国国内市场还没有完全商品化的奶牛孕酮检测试剂盒成品，而进口试剂盒价格昂贵，为此，亟需生产成本低廉、结果迅速、便于现场操作的孕酮检测试纸条，以期为国内养殖市场提供参考。
　　本研究以甾体类激素孕酮为研究对象，牛血清白蛋白与孕酮的偶联物为免疫抗原，注射到小鼠体内使其产生抗体，细胞融合筛选制备抗孕酮单克隆抗体，研制快速检测母牛奶汁中孕酮含量的胶体金免疫层析试纸条(colloidal gold immunochromatographic strip, CGIS)，为孕酮快速诊断提供技术支持，主要研究内容如下：
　　1.孕酮单克隆抗体的制备及鉴定
　　本研究采用琥珀酸酐法活化11α-羟孕酮，继而采用碳二亚胺法使其与牛血清白蛋白、卵清白蛋白相偶联，制备出用以免疫小鼠的免疫抗原和用以间接ELISA方法确定微量浓度的检测抗原，并对其进行免疫学鉴定和分子生物学鉴定，然后根据不同的免疫程序，选择效价最高的小鼠脾细胞用以融合。采用经典聚乙二醇细胞融合法，经三次融合，通过间接ELISA方法筛选出三种能够稳定分泌抗孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2H3、2C3、C3H11，细胞上清液效价分别是1∶800、1∶800、1∶1600。其中C3H11亚型为IgG2a，2H3、2C3均为IgG2b，所分泌的McAb均可以和游离孕酮发生非特异性结合。三次正式对三株P-McAb的测定中，C3H11灵敏度最高，亲和力测定结果为C3H11＞2H3＞2C3。最后将三株单克隆抗体注射到10周龄BALB/c雄性小鼠体内使其产生相应的腹水，腹水效价测定值分别是1∶3200、1∶6400、1∶6400。
　　2.孕酮胶体金试纸条快速检测方法的确立
　　本实验采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，结果显示金溶液与单抗C3H11结合最佳PH为K2CO3=7μl，最佳蛋白标记量为2.4μl。C3H11经胶体金标记后得到金标抗体，用划线仪将11α-羟孕酮琥珀酸酯与牛血清白蛋白的偶联物和羊抗鼠IGg分别作为检测带(T线)和质控带(C线)包被到硝酸纤维素膜上，浓度设定1.0μg/μL和1.1μg/μL。将金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上(5μl/cm)，组建制备免疫层析胶体金检测试纸。检测在2-3分钟内出现结果，肉眼判断颜色即可判断母牛怀孕情况。
　　综上所述，利用单克隆抗体C3H11腹水初步制备的基于孕酮单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条对孕酮检测结果为阳性，对雌激素、雌二醇、睾酮的检测结果均为阴性，特异性较好，针对孕酮的最低检测限为20ng/ml，敏感性较好，适用于对奶牛妊娠早期孕酮水平的检测。